PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Nguyên liệu

2.3.1.1. Thiết bị và dụng cụ

- Tủ lạnh âm -20 0C, -80 0C; tủ lạnh thường 2- 8 0C. - Tủ ấm 37 0C.

- Buồng an toàn sinh học cấp II, buồng an toàn sinh học PCR. - Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm.

- Máy ly tâm lạnh ống eppendorf, máy ly tâm ống lớn, máy ly tâm ống nhỏ. - Bể hấp cách thủy, máy trộn ống nghiệm.

- Máy Realtime PCR Biorad.

- Bộ micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau, các ống đựng nguyên liệu 15ml, 50ml, tube PCR, giá đỡ tube PCR, đĩa chạy PCR.

- Đầu típ các cỡ 10, 20, 100, 200 và 1000µl sử dụng cho micropipet (có lọc và không lọc).

- Bình tam giác, ống đong thủy tinh, cốc có mỏ...

- Tăm bông, dụng cụ bảo hộ khác (găng tay, khẩu trang...).

2.3.1.2. Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm:

- Mẫu dịch hầu họng (dịchs) của gia cầm.

- Các loại hóa chất: Na2HPO4, Na2HPO4.H2O, NaCl, HCl, NaOH.

- Nước dùng cho sinh học phân tử không có Rnase. - Ethanol tuyệt đối.

- Kít chiết tách RNA QIAamp® Viral RNA Mini KIT

- Nguyên liệu nhân gen Invitrogen Superscrip One-step RT-PCR Kít. - PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).

- MgCl2 (Promega) 25mM. - Danh sách primer và prober:

PPP Name (Source) Primer/ Probe Sequence (5 ’ -3’) 5’ 3’ Matrix

Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1

Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None

Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None

H5-9S

Probe FAM-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-

BHQ1 FAM BHQ1

Forward ACATATGACTACCCACARTATTCAG None None

Reverse 1 AGACCAGCTAYCATGATTGC None None

Reverse 2 AAACCAGCCACTATGATTGC None None

N1-2 China

Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1

Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None

Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None

N6-1

Probe FAM-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-

BHQ1 FAM BHQ1

Forward CCCCACCAATGGGAACTG None None

Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None

H7-6 Coda

Probe 5’-FAM- TGGTTTAGCTTCGGGGCATCATG -

BHQ1-3’ FAM BHQ1

Forward 5’- GYAGYGGYTACAAAGATGTG -3’ None None

Reverse 5’- GAAGACAAGGCCCATTGCAA -3’ None None

N9-1 CNIC

Probe 5’-FAM-AGACAATCCCCGACCGAATGACCC -

BHQ1-3’ FAM BHQ1

Forward 5’- TAGCAATGACACACACTAGTCAAT -3’ None None

2.3.2. Bố trí thí nghiệm

- Để nghiên cứu đặc điểm dịch tễ và xây dựng bản đồ dịch tễ bệnh cúm gia cầm trên địa bàn huyện Bố Trạch từ năm 2012 đến năm 2017, chúng tôi sử dụng các kênh thông tin như báo cáo của Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Bình, báo cáo của Trạm Chăn nuôi và Thú y huyện Bố Trạch về tổng số hộ nuôi, số hộ bị bệnh cúm gia cầm và phân bố hộ nuôi gia cầm trên địa bàn huyện Bố Trạch. Các dữ liệu này là cơ sở để xác định số mẫu điều tra và phân bố mẫu điều tra cho hợp lý.

- Số phiếu điều tra được lấy ngẫu nhiên và phân theo nhóm khu vực và theo hộ khảo sát:

+ Phân nhóm theo khu vực khảo sát: dựa vào điều kiện tự nhiên và hoạt động liên quan đến chăn nuôi gia cầm, ưu tiên lựa chọn các xã ổ dịch cũ, vùng nguy cơ cao. Trong đề tài chúng tôi chia 3 khu vực:

Bảng 2.1. Các xã trong khu vực khảo sát

Khu vực Xã trong khu vực

Khu vực I Sơn Trạch, Phúc Trạch

Khu vực II Đồng Trạch, Hạ Trạch, Hoàn Trạch Khu vực III Trung Trạch, Đại Trạch, Thanh Trạch

Khu vực I gồm các xã miền núi, giáp miền núi nhiều sông suối, thường bị ngập lụt vào tháng 9 tháng 10 hàng năm, nhiều hộ chăn nuôi nhỏ lẻ thả vườn hơn nhóm còn lại.

Khu vực II gồm các xã đồng bằng, trung du, có địa hình ổn định, chăn nuôi gia cầm phát triển mạnh, nhiều trang trại chăn nuôi tập trung công nghiệp và bán công nghiệp hơn khu vực còn lại, tổng đàn gia cầm lớn nhất. Đặc biệt có đường giao thông quốc lộ 1A đi qua, có nhiều điểm giết mổ gia súc, gia cầm.

Khu vực III gồm các xã ven biển có nguồn nước nhiễm mặn, có các vườn cò tự nhiên, chăn nuôi chủ yếu thả đồng.

Bảng 2.2. Phân bố phiếu điều tra

Khu vực Tổng số hộ nuôi gia cầm Dự kiến số phiếu điều tra

Khu vực I 220 30

Khu vực II 374 50

Khu vực III 245 30

Tổng cộng 774 110

* Ghi chú: Mẫu phiếu điều tra sẽ được lấy theo ngẫu nhiên phân nhóm, từ đó tổng hợp, phân tích và đánh giá mức độ nguy cơ phát sinh và lây lan bệnh.

- Nhóm hộ khảo sát phân thành hai nhóm để tiến hành nghiên cứu.

Nhóm 1: gồm 37 hộ có gia cầm mắc bệnh cúm hoặc có kết quả lấy mẫu dương tính với gen M trong giai đoạn 2012-2017

Nhóm 2: gồm 73 hộ không có gia cầm mắc bệnh xung quanh các ổ dịch và ở các xã lân cận.

- Cấu trúc bộ câu hỏi gồm các phần: phần thông tin chung về cơ sở nuôi, phần thông tin về các biện pháp kỹ thuật và thông tin về dịch bệnh Cúm gia cầm.

- Để giám sát sự lưu hành type virus cúm gia cầm chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng trên đàn gia cầm sống của các hộ chăn nuôi ngẫu nhiên theo 03 vùng (Miền núi, đồng bằng trung du, ven biển).Thông qua số liệu trung bình, tỷ lệ lưu hành, so sánh sự sai khác giữa 03 vùng (Miền núi, đồng bằng trung du, ven biển).

- Sử dụng kit chẩn đoán bệnh của hãng Quigen và one step để phát hiện mẫu dương tính với virus cúm gia cầm bằng phương pháp Realtime RT- PCR.

- Giải trình tự gen HA bằng phương pháp Sanger dideoxy sequencing (1st Base, Singapore).

2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học

Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả và dịch tễ phân tích được giới thiệu bởi Đào Ngọc Phong (2001) được sử dụng cho nghiên cứu này.

Để có dữ liệu phân tích các yếu tố nguy cơ của bệnh, phương pháp điều tra hồi cứu cũng đã được thực hiện để tìm hiểu tình trạng bệnh xảy ra trong những năm đã qua kèm theo các yếu tố liên quan để phân tích, đo lường sự tiếp xúc với tình trạng bệnh tật.

Các yếu tố nguy cơ của bệnh được phân tích dựa vào chỉ số nguy cơ tương đối (Relative Rick - RR)

Nguy cơ tương đối đánh giá mức độ kết hợp giữa phơi nhiễm với một yếu tố nguy cơ và bệnh, nói lên khả năng phát triển bệnh một cách tương đối ở nhóm bệnh có phơi nhiễm. Chỉ số nguy cơ tương đối được tính theo công thức:

Nguy cơ bệnh ở nhóm tiếp xúc a/(a +b)

RR = =

Nguy cơ bệnh ở nhóm không tiếp xúc c/(c + d)

* Chú thích: Giá trị và ý nghĩa của các chữ a, b, c, d được chú thích ở bảng 2.3

Bảng 2.3. Trình bày số liệu trong nghiên cứu hồi quy

BỆNH Có Không Tổng TIẾP XÚC NGUY CƠ Có a b a + b Không c d c + d Tổng a + c b + d

RR>1: Yếu tố nguy cơ có liên quan đến bệnh (nguy cơ tăng) RR=1: Không có ảnh hưởng, khác nhau giữa hai nhóm.

RR<1: Nguy cơ giảm (khi đối tượng nghiên cứu được bảo vệ).

Giả thuyết Ho: Các yếu tố nguy cơ không có sự sai khác trong việc làm phát sinh dịch bệnh cúm gia cầm tại địa bàn nghiên cứu.

P>0,05: Chấp nhận Ho

P<0,05: Không chấp nhận Ho (Sự sai khác giữa các yếu tố nguy cơ trong việc làm phát sinh bệnh cúm gi cầm tại địa bàn nghiên cứu là giá trị OR lần).

2.3.4. Phương pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm

Cách lấy mẫu dịch hầu họng: Đưa tăm bông vào sâu trong họng của gà, vịt rồi ngoáy thu dịch nhầy sau đó từ từ rút ra đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. Que ngoáy được bảo quản trong dung dịch đệm PBS 0,01M pH = 7,2 (phosphate buffered saline).

Mẫu sau khi được lấy tại các hộ chăn nuôi được bảo quản bảo quản lạnh 2oC – 8oC và gửi ngay về Phân viện Thú y miền trung để tiến hành xét nghiệm xác định sự lưu hành của virus CGC.

Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển được thực hiện theo Quy chuẩn Việt Nam QCVN 01-83:2011/BNNPTNT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật- yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm bảo quản và vận chuyển.

2.3.5. Số lượng mẫu

Dung lượng mẫu được tính theo công thức N=(1,96)2p(1-p)/d2 với độ tin cậy 95%, sai số ước lượng d=0,05. Với tỷ lệ dự đoán p= 8,83% theo kết quả giám sát của Chi cục Chăn nuôi và Thú y Quảng Bình (2016).

- Tại mỗi khu vực, mỗi lần lấy 20 mẫu dịch đơn hầu họng của gà sống (gồm 10

mẫu gà/hộ x 02 hộ chăn nuôi gia cầm). Gộp 10 mẫu swab đơn của một hộ thành một mẫu xét nghiệm, gộp ngay tại hộ lấy mẫu.

Tần suất lấy mẫu mỗi khu vực 4 tuần/1 vòng. Tổng số là 6 vòng lấy mẫu với 360 mẫu đơn tương đương 36 mẫu gộp.

2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu nhập và xử lý sơ bộ trên phần mềm Excel và xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 20.

Sử dụng phần mềm Quantum Gis để vẽ bản đồ dịch tễ bệnh qua các năm 2012 – 2017.

Cách tính tỷ lệ dương tính (%) = (Số mẫu dương tính / số mẫu kiểm tra)

Xử lý số liệu các chuỗi gen thu nhận được với các chuỗi có trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank) bằng chương trình BLAST.

2.3.7. Phương pháp Realtime RT-PCR

* Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR xác định lượng virus CGC.

- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản. - Nước cất vô trùng (Rnase-free).

- RNA đối chứng dương tính M, H5 của virus cúm A/H5N1, A/H5N6. - Hai đoạn mồi oligonucleotit (primer) và probe (mẫu dò).

- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.

- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP. - Dung dịch đệm, Mg2+...

* Các bước tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR

- Xử lý mẫu dùng cho chiết tách RNA tổng số

+ Vortex ống mẫu (15-30s), bỏ tăm bông, để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Hút pha nước phía trên sang ống eppendorf mới có đánh ký hiệu mẫu.

+ Bảo quản 40C trong thời gian ngăn (48h). Nếu lưu mẫu thời gian dài thì để ở âm 700C.

- Chiết tách RNA bằng kit QIAamp Viral RNR Mini

+ Cho 560l dung môi AVL vào ống 1,5ml. Cho tiếp 5,6l dung môi carrier RNA. + Cho tiếp 140l dung dịch mẫu. Sau đó vortex trong 15 giây.

+ Ủ ở nhiệt độ phòng (15-200C) trong 10 phút, sau đó ly tâm nhanh.

+ Cho vào 560l Ethanol (96-100%). Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm nhanh. + Chuyển 630l hỗn dịch vào cột lọc với ống thu (collection tube). Ly tâm trong 1 phút ở 6,000g (8000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc qua ống thu mới.

+ Cho 500l dung môi AW1 vào cột lọc. Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc vào ống 1,5ml mới.

+ Cho 60l dung môi AVE vào cột lọc. Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm). Bảo quản dung dịch RNA ở âm 200C trong thời gian ngắn (1-2 ngày), ở âm 700C trong thời gian dài.

- Chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix)

Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng. Chuẩn bị ống eppendorf, tiến hành vortex và spin các ống nguyên liệu sau đó lần lượt cho vào ống eppendorf các thành phần với lượng như sau (bảng 2.4)

Bảng 2.4. Thành phần của master mix

TT Nguyên liệu Lượng (µl)

1 DW 4,3

2 2X ReactionBuffer 7,5

PPP

Primer forward (40uM)

0,9 Primer reverse (40uM)

Probe (10uM)

3 Enzyme mix 0,3

Tổng 13

Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15 giây.

- Thực hiện phản ứng

Trước khi tiến hành các phản ứng cần chuẩn bị một số ống eppendorf 0,2 ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành các bước sau:

1) Cho 13µl hỗn hợp master mix vào các tube 0,2 ml.

2) Cho 2µl nước free RNase vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng âm. 3) Cho 2µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp master mix của các tube mẫu.

4) Cho 2µl mẫu đối chứng dương vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng dương.

Khi thực hiện phải tuân thủ theo trình tự trên, sau mỗi lần cho mẫu vào phải tiến hành đậy nắp ống phản ứng để tránh tạp nhiễm. Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu vào phản ứng theo quy định.

Cho toàn bộ các ống phản ứng vào spin down để khỏi dính vào thành ống rồi chuyển sang phòng chạy PCR.

- Chạy trên máy Realtime PCR

Trước khi cài đặt, vận hành máy cần đặt các tube phản ứng vào giếng (well) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích biểu tượng Biorad để tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu, cài đặt màu cho probe và cài đặt chu trình nhiệt. Sau khi khai báo xong thì bắt đầu chạy máy.

Invitrogen One-step RT-PCR Kít thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu trình luân nhiệt trên máy Biorad như sau (bảng 2.5).

Bảng 2.5. Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT-PCR

Quá trình Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

RT 50 0 C 15phút 1 950C 2 phút PCR 95 0 C 10 giây 40 600C 40 giây - Đọc kết quả

Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, nếu trong mẫu dịch có virus cúm A/H5N1; A/H5N6; A/H7N9 trình tự nucleotit của các gen M, H5, H7 và N1, N6, N9 sẽ được khuếch đại đặc hiệu thông qua những đoạn mồi chuyên biệt. Việc xác định sự có mặt của virus thông qua phần mềm tạo đường cong và chu kỳ ngưỡng (Ct). Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct:

+ Đối chứng dương tính cho giá trị Ct dao động trong khoảng ±2 so với giá trị Ct đã biết.

+ Đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

+ Mẫu dương tính khi đường cong khuyếch đại tương tự như đường cong đối chứng dương và giá trị Ct ≤ 35.

+ Kết quả được xem là âm tính, khi không có sự khuếch đại đặc hiệu, đường cong khuếch đại giống như đối chứng âm tính và không cho giá trị Ct.

+ Mẫu được xác định là nghi ngờ khi đường cong khuếch đại giống đối chứng dương nhưng giá trị ngưỡng Ct >35.

2.3.8. Giải trình tự gen HA bằng phương pháp Sanger dideoxy sequencing

Bước 1: Tách chiết RNA hệ gen của virus bằng bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN)- protocol, từ mẫu bệnh phẩm là dịch hầu họng chứa virus cúm A/H5N6 thu thập trong quá trình giám sát sự lưu hành virus trong 6 tháng từ tháng 8/2017 đến tháng 1/2018, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bước 2: Toàn bộ phân đoạn HA của chúng virus cúm A/H5N6 được thu nhận bằng phản ứng RT-PCR với thành phần phản ứng gồm:

Thành phần phảnứng Thể tích (µl) Master mix 12,5 Nướcsiêusạch 5,5 Mồixuôi 1 Mồingược 1 RNA 5 Tổng 25 Và chu kỳ nhiệt

Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

50oC 15 phút 01 94OC 2 phút 94oC 30 giây 40 54OC 30 giây 68 oC 1phút 68oC 5 phút 01

Bước 3: Sản phẩm RT-PCR được kiểm tra trên agarose 1%

Bước 4: Tinh sạch cDNA từ gel agarose bằng kit QIAquickgelextraction kit Bước 5: Trình tự của nucleotide DNA của plasmid được giải trình tự bằng phương pháp Sanger dideoxy sequencing (1st Base, Singapore). Chuỗi nucleotide được xử lý, chỉnh lề bằng chương trình Bioedit thành phần amino acid được thu nhận bằng cách sử dụng bộ mã của vi sinh vật bậc thấp (vi khuẩn) trong ngân hàng gen. So sánh đối chiếu, xử lý số liệu các chuỗi bằng chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. DIỄN BIẾN DỊCH CÚM GIA CẦM TẠI HUYỆN BỐ TRẠCH TỪ NĂM 2012 - 2017

3.1.1. Phân bố các ổ dịch cúm gia cầm theo thời gian

Bảng 3.1. Diễn biến dịch cúm gia cầm theo thời gian tại huyện Bố Trạchgiai đoạn

2012-2017 Năm Số địa phương và hộ có dịch Tổng số mắc bệnh Gà (con) Vịt (con) Xã Thôn Hộ Số mắc Tỷ lệ (%) Số mắc Tỷ lệ (%) 2012 05 6 20 10072 1200 11,914 8872 88,086 2013 0 0 0 0 0 0 0 0 2014 01 01 02 2770 2750 99,278 20 0,722 2015 0 0 0 0 0 0 0 0 2016 0 0 0 0 0 0 0 0 2017 0 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 12842 3950 30,758 8892 69,242

Qua bảng 3.1 ta thấy diễn biến dịch cúm gia cầm trên địa bàn huyện Bố Trạch giai đoạn 2012-2017 như sau: