sinh mạnh ứng dụng trong sản xuất bánh mì
Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men Nuôi cấy tăng sinh
Các mẫu trái cây như chuối, xoài, cam, vải, mận, dứa, đào, quýt, táo, ổi cắt lát. Lấy 2 ống nghiệm cho mỗi mẫu trái cây cần sử dụng, mỗi ống nghiệm 10ml môi trường yeast extract peptone dextrose (YEPD) không có agar đã khử trùng, sau đó lấy 5g mẫu trái cây cho vào ống nghiệm nuôi cấy tăng sinh trong 2 ngày tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men phát triển.
Pha loãng và cấy trang (cấy trải)
Sau 2 - 3 ngày dung dịch nuôi cấy các mẫu trái cây được pha loãng hàng loạt theo các mức độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Mỗi độ pha loãng được cấy lên các đĩa petri bổ sung chloramphenocol 0,4%. Dùng micro pipet hút 100 µl dịch pha loãng ở mỗi nồng độ chuyển lên trên bề mặt môi trường thạch YEPD trong đĩa petri. Sử dụng que cấy tam giác trang đều dung dịch pha loãng trên bề mặt thạch cho tới khi bề mặt môi trường khô. Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, theo dõi sau 12 - 24 giờ cho đến khi hình thành khuẩn lạc [4].
Cấy ria
Từ các nồng độ pha loãng sẽ thu được các mật độ vi sinh vật khác nhau. Với những nồng độ thấp sẽ cho các khuẩn lạc đứng độc lập riêng rẽ. Tiến hành cấy ria nhằm thu nhận những chủng vi sinh vật tinh sạch. Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa để nguội, hơ nóng đĩa petri, chấm nhẹ que cấy vào khuẩn lạc đứng độc lập, tiến hành cấy ria 3 đường khác nhau. Sau mỗi lần ria cần đốt đỏ que cấy một lần. Nuôi cấy các đĩa petri ở nhiệt độ phòng, theo dõi sau 12 - 24 giờ đến khi hình thành khuẩn lạc.
Quan sát hình thái
Mỗi khuẩn lạc vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường YEPD trộn trong một giọt nước cất vô trùng trên phiến kính, đậy lamen, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 40.
Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm tế bào nấm men
Dùng micropipet lấy một giọt mẫu cần xác định nồng độ tế bào, cho vào khe hở giữa buồng đếm và lamelle. Đếm số tế bào nấm men dưới kính hiển vi, nên đếm lặp lại ít nhất 4 ô lớn. Nếu nồng độ tế bào quá lớn (lớn hơn 200 tế bào trong 1 ô lớn), tiến hành pha loãng. Chú ý tránh để nấm men lắng xuống trong thời gian lấy mẫu. Tùy vào số lượng tế bào mà có thể đếm tất cả tế bào có trong ô hay chỉ đếm tế các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện. Đếm theo hình zizac từ trái qua phải, từ trên xuống dưới. Đếm tất các các tế bào nấm men nằm bên trong của 16 ô, những tế bào nấm men nằm cạnh ngoài của 16 ô thì chỉ đếm tế bào nấm men ở cạnh trên và cạnh trái (và chỉ những tế bào nấm men nằm vào phía trong ít nhất 1/2) [3].
Bảo quản và giữ giống
Từ những mẫu cấy ria sẽ lấy ra những mấu có sinh trưởng tốt nhất để cấy chuyển vào trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường YEPD có nút bông. Tiếp theo những mẫu này sẽ được nuôi cấy trong tủ ấm trong khoảng 24 giờ để tiếp tục tăng sinh. Cuối cùng, cất giữ ở điều kiện 40C.
Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới sự tăng trưởng của nấm men
Phân tích quang phổ
Chỉnh bước sóng máy quang phổ về 600nm và chuẩn bị Blank bằng dung dịch YEPD vô trùng. Chuyển 1 ml dung dịch nuôi cấy chủng nấm men phân lập được pha loãng với 1 ml dung dịch YEPD vào cuvette. Độ hấp thụ của huyền phù tế bào được ghi lại và quá trình được lặp lại trong khoảng thời gian 1-24 giờ. Đánh giá ảnh hưởng của thời gian [11].
Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian nuối lắc tới sự phát triển của nấm men
Chủng nấm men phân lập được được nuôi trong môi trường YEPD lỏng, lắc ở tốc độ 180 Rpm, nhiệt độ phòng. Từ thời điểm 3 tiếng sau khi cấy, tiến hành đo OD theo chu kì 1 tiếng 1 lần. Việc tăng giá trị OD là căn cứ để đánh giá mức độ tăng của nồng độ nấm men trong dung dịch.
Để thử nghiệm thời gian nuôi lắc thích hợp, sau 24h nuôi cấy trong môi trường lỏng là giai đoạn chủng nấm men đi vào pha tăng trưởng logarit. Tiến hành thu nhận 300 ml môi trường nuôi lắc, ly tâm loại bỏ dịch kháng sinh, bổ sung nước cất và thử nghiệm làm bột nhào. Kích thước bột nhào được đánh giá sau 2h nuôi ủ.