II. Phản ứng miễn dịch
2. Quy trình thực hiện khuếch tán 1 Pha huyền dịch vi khuẩn
2.1. Pha huyền dịch vi khuẩn
Trên mặt thạch phân lập, chọn ít nhất từ ba đến năm khuẩn lạc giống nhau và tách rời. Dùng que cấy chạm vòng cấy chạm vào đầu mỗi khúm vi khuẩn rồi cấy chuyển vào 4 - 5 ml dung dịch nước muối sinh lý 9‰. Điều chỉnh độ đục của dịch cấy khuẩn tương đương độ đục chuẩn 0.5 McFarland. Huyền dịch vi khuẩn như vậy có chứa khoảng 1 đến 2 x 108 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit, đơn vị hình thành khuẩn lạc: vi khuẩn sống).
2.2. Trải vi khuẩn lên mặt thạch
Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng một que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch, ép và xoay nhẹ que gòn trên thành ống nghiệm. Động tác này sẽ loại bỏ được lượng huyền dịch vi khuẩn thừa khỏi que gòn.
Trải đầy vi khuẩn từ que gòn lên mặt thạch Mueller - Hinton đã hong khô bề mặt trước đó. Trải bằng cách vạch que gòn lên mặt thạch, xong lại xoay mặt thạch 60o rồi cấy vạch một lần nữa, và tiếp như vậy để đảm bảo trải đầy được vi khuẩn lên mặt thạch.
Để hộp thạch đã trải vi khuẩn trong vòng 3 đến 5 phút (không quá 15 phút) để cho khô mặt trước khi đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch.
2.3. Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn
Xác định bộ đĩa kháng sinh nào nên đặt lên mặt thạch. Khi đặt, phải ép nhẹ mỗi đĩa để đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Đặt các đĩa kháng sinh phải đảm bảo các
tâm đĩa kháng sinh không gần nhau dưới 24 mm. Thường với một hộp thạch đường kính 150 mm, không đặt quá 12 đĩa hay quá 7 đĩa với hộp thạch đường kính 90mm. Kháng sinh khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy không nên dời chỗ các đĩa kháng sinh khi đã đặt lên mặt thạch.
Trong vòng 15 phút sau khi đã đặt đĩa kháng, phải ủ sấp hộp thạch (đáy trên nắp dưới) trong tủ ủ 35oC.
Hình 13: Quy trình thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ (Khuếch tán kháng sinh trong thạch).
2.4. Đọc và biện luận kết quả
Sau khi ủ 16 đến 18 giờ, đọc kết quả các hộp thạch. Nếu mặt thạch được trải vi khuẩn đúng cách, và nếu dịch cấy khuẩn đúng độ đục, vi khuẩn sẽ mọc thành những khúm mịn tiếp xúc nhau, và vòng vô khuẩn sẽ là vòng tròn đồng nhất. Nếu vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc riêng lẻ thì có nghĩa là huyền phù vi khuẩn quá loãng, phải làm lại thí nghiệm. Đo đường kính vòng vô khuẩn là một vòng, kể cả đường kính đĩa kháng sinh, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc thấy được bằng mắt thường.
Đo đường kính vòng vô khuẩn thành mi-li-mét với thước compa trượt hay thước kẻ, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp thạch. Chu vi vòng vô khuẩn là vùng mà mắt thường không thể thấy được vi khuẩn mọc.
Biện luận đường kính vòng vô khuẩn dựa theo bảng đánh giá theo tiêu chuẩn, và ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy hay trung gian hay đề kháng đối với kháng sinh thử nghiệm.
Sai lệch kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ
Có thể có các sai lầm sau làm sai lệch các kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán:
- Đọc sai khi đo đường kính vòng vô khuẩn.
- Ngoại nhiễm các vi khuẩn khác trong huyền dịch vi khuẩn kiểm tra. - Huyền dịch vi khuẩn quá đậm hoặc quá nhạt.
- Không lắc đều độ đục chuẩn 0.5 McFarland hay độ đục chuẩn bị hỏng. - Nhiệt độ hay khí trường ủ không đúng.
- Môi trường kháng sinh đồ không đạt chuẩn (nên kiểm tra mỗi lô môi trường mới trước khi sử dụng).
- Mất hàm lượng kháng sinh trong đĩa trong quá trình dùng và bảo quản tại phòng thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Étienne lévy-lambert, 1978, Techniques de base pour le laboratoire médical - Kỹ thuật cơ bản của phòng xét nghiệm, người dịch: Nguyễn Viết Thọ - Nguyễn Xuân Thiều, NXB Y học.
2.Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng, 2001, Thực tập Vi sinh cơ sở, NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
3.Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006, Thí nghiệm Vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
4.Phạm Hùng Vân, 2002, Cẩm nang các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Bộ Y tế, Trường Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh.
5.Tài liệu thực tập Vi sinh vật học, 2010, Đại học Huế, Trường Đại học Y dược, Bộ môn Vi sinh vật.
6.Trần Linh Thước, 2006, Phương pháp phân tích Vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục.