Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.1.5 ở bƣớc sĩng 258 nm, kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.2:
Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin
Mẫu Nồng độ (g/l) Độ hấp thụ 1 0,0020 0,641 2 0,0018 0,576 3 0,0014 0,441 4 0,0010 0,319 5 0,0008 0,259 6 0,0006 0,197
Trắc nghiệm t: Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b theo phƣơng trình hồi quy:
y = 317x + 0,003.
Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj khơng cĩ ý nghĩa thống kê”. HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj cĩ ý nghĩa thống kê”.
- t0,05 (n-2) = 2,77.
- t0 = 0,86 < t0,05 (n-2) = 2,77 chấp nhận H0 hệ số b khơng cĩ ý nghĩa thống kê.
- t0 = 94,39 > t0,05 (n-2) = 2,77 chấp nhận HA hệ số a cĩ ý nghĩa thống kê.
Trắc nghiệm f: Kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy.
Giả thuyết H0: Bj = 0 “Phƣơng trình hồi quy khơng tƣơng thích”. HA: Bj ≠ 0 “Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích”.
- f0,05 = 7,71.
- f = 8910,16 > f0,05 chấp nhận HA phƣơng trình hồi quy tƣơng thích.
y = 317.0x + 0.003 R² = 0.999 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 Độ hấp thu A Nồng độ vinblastine sulfate (g/l)
Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastine sulfat
Nhận xét: Kết quả trên cho thấy cĩ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của vinblastin sulfat theo phƣơng trình y = 317x, R2= 0,999 trong khoảng nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006 - 0,002 g/l.
Nhận xét chung:
Ta chiết vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng cách chuyển vinblastin ở dạng muối thành vinblastin base và dùng dung mơi hữu cơ để chiết vinblastin base ra khỏi dung dịch. Sau khi tiến hành định tính dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin và dịch chiết đƣợc từ thuốc tiêm thì kết quả cho thấy cĩ alkaloid trong cả 2 dung dịch. Đồng thời, khi xác định khối lƣợng phân tử của chất đã chiết đƣợc bằng phƣơng pháp MS, ta thấy khối lƣợng phân tử của chất đã chiết tƣơng đƣơng với khối lƣợng phân tử của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V (M = 811,0 g/mol). Chứng tỏ cĩ alkaloid (định tính vinblastin) trong dịch chiết này.
Khảo sát cực đại hấp thụ của chất đã chiết và vinblastin sulfat trong thuốc tiêm, ta thấy cả 2 mẫu đều cĩ cực đại hấp thụ tại 258 nm. Chọn bƣớc sĩng 258 nm là bƣớc sĩng để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.
Sau khi tiến hành thực nghiệm, ta thấy cĩ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của vinblastin sulfat trong mơi trƣờng nƣớc ở khoảng nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006-0,002 g/l.
3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật 3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật
Bột Dừa cạn tồn cây cĩ màu vàng nhạt, khơng mùi, vị đắng. Các cấu tử đƣợc tìm thấy trong bột dƣợc liệu gồm cĩ: mảnh bần, mảnh mơ mềm cĩ chứa tinh bột, mảnh mạch vịng, mạch xoắn, mạch vạch, lơng che chở đơn bào hay đa bào.
Nhận xét: Bột dƣợc liệu Dừa cạn cĩ các cấu tử đặc trƣng của bột cây Dừa cạn theo DĐVN V [1].
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(a) Mảnh bần (b) Mảnh mơ mềm cĩ tinh bột (c) Mạch vịng
(d) Mạch xoắn (e) Mạch vạch (f) Lơng che chở đơn bào Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn
3.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu Dừa cạn 3.2.2.1. Phản ứng hĩa học
Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.2.2, sau đĩ lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml.
- Ống 1 (Ống chứng): Khơng thêm thuốc thử. - Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT).
- Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT).
- Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT).
- Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT).
- Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT).
Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1 (ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.3:
Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu bằng phƣơng pháp hĩa học
Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á
1 Khơng thêm thuốc thử
2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++
3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++
4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng +
5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng ++
6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++
Chú thích: (+) Dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút
(+++) Cĩ tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2
Nhận xét: Dịch chiết cho phản ứng dƣơng tính với tất cả các thuốc thử chung alkaloid, điều đĩ chứng tỏ trong mẫu dƣợc liệu cĩ chứa alkaloid.
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff
3.2.2.2. Sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị 2 mẫu nhƣ mục (b) phần 2.2.2.2 và tiến hành sắc ký với điều kiện: - Bản mỏng: Silica gel F254.
- Dung mơi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1).
- Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.
(a) (b) (c) (d)
Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng bƣớc sĩng 254 nm, sắc ký đồ của dịch chiết từ cây Dừa cạn (T) cho vết tƣơng đƣơng với vết trên sắc ký đồ của vinblastin (C). Đồng thời, khi phun thuốc thử
Dragendorff, trên sắc ký đồ của 2 dung dịch cho 2 vết màu cam cĩ cùng Rf.
Nhận xét chung:
Từ kết quả thực nghiệm ở các mục 3.2.2.1, 3.2.2.2 thu đƣợc:
+ Khi thực hiện phản ứng hĩa học, dịch chiết Dừa cạn cho phản ứng dƣơng tính với thuốc thử chung alkaloid, chứng tỏ đƣợc rằng Dừa cạn cĩ chứa các hợp chất alkaloid.
+ Khi tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu là vinblastin (đã xác định đƣợc trong mục 3.2.1) thì chứng minh đƣợc rằng trong mẫu dịch chiết Dừa cạn cĩ chứa vinblastin, một vinca alkaloid cĩ trong cây Dừa cạn.
3.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn
3.2.3.1. Khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1)
Thực hiện chiết bột Dừa cạn với ethanol 50%, 80% và 96% theo quy trình chiết xuất hình 3.8. Sử dụng dung mơi khảo sát ở bƣớc 2 là Toluen và bƣớc 3 là Chloroform. Đánh giá bằng cách xác định khối lƣợng cao alkaloid tồn phần thu đƣợc (m2), sắc ký đồ của các dịch chiết (dịch B) cũng nhƣ các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quy trình chiết xuất. Thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.4:
Triển khai SKLM Bột dƣợc liệu (50 g)
Dịch lọc
Dịch nƣớc cịn lại Dịch dung mơi (A)
- Ngâm lạnh với dung mơi 1
- Rút dịch chiết, cơ bớt dung mơi để đƣợc cao lỏng - Lọc
- Lắc phân bố với dung mơi 2 (10 ml x 3 lần)
- Acid hĩa bằng HCl 2% đến pH = 1-2 - Kiềm hĩa bằng NH3 đđ đến pH = 10 - Chiết bằng dung mơi hữu cơ 3 Cắn khơ (m1)
- Cơ thu hồi dung mơi
Dịch dung mơi (B)
Cao khơ (m2)
- Cơ thu hồi dung mơi
- Sấy đến khối lƣợng khơng đổi Định tính alkaloid bằng
thuốc thử chung và SKLM
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích: (C) Vinblastine đối chứng
(50) Cao chiết với ethanol 50 % (80) Cao chiết với ethanol 80 % (96) Cao chiết với ethanol 96 %
Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1)
Stt Dung mơi chiết Khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (g)
1 Ethanol 50 % 0,4976
2 Ethanol 80 % 0,5013
3 Ethanol 96 % 0,4797
(a) (b) (c) (d) Hình 3. 9. Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1
Nhận xét: Hiệu suất chiết cao alkaloid trong trƣờng hợp chiết bằng ethanol 50 % và 80 % là gần bằng nhau, trên sắc ký đồ dịch chiết từ ethanol 50 % cũng cĩ các vết tƣơng đƣơng với các vết của dịch chiết từ ethanol 80 %. Trong khi đĩ, cao alkaloid thu đƣợc khi chiết bằng ethanol 96 % ít hơn, đồng thời cũng cĩ ít vết trên sắc ký đồ hơn so với 2 dịch chiết trên.
Vậy ethanol 50 % hoặc 80 % sẽ thích hợp để chiết xuất alkaloid từ Dừa cạn hơn ethanol 96%.
Tuy nhiên, trong quá trình chiết, sau khi cơ loại bỏ dung mơi ở bƣớc 1, khi lọc cao lỏng, phần cao lỏng ethanol 50% khĩ lọc hơn phần cao lỏng ethanol 80% vì cĩ nhiều tủa li ti gây tắc lọc, do đĩ gây khĩ khăn cho quá trình chiết xuất. Vậy chọn
ethanol 80% làm dung mơi chiết ở bƣớc 1.
3.2.3.2. Khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bƣớc 2 (theo hình 2.1)
Thực hiện chiết bột Dừa cạn, sau đĩ khảo sát khả năng loại chlorophyll của 4 dung mơi khác nhau. Sử dụng dung mơi bƣớc 1 là dung mơi đã khảo sát đƣợc ở mục 3.2.3.1, dung mơi ở bƣớc 3 là Chloroform. Đánh giá các dung mơi này dựa trên: Cao alkaloid tồn phần, sắc ký đồ của dịch dung mơi loại chlorophyll (dịch A), định tính alkaloid trong dịch A, sắc ký đồ của dịch alkaloid tồn phần (dịch B).
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff
Chú thích: (H): Dịch hexan (T): Dịch toluen
(E): Dịch ethyl acetat
Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bƣớc 2
Stt Dung mơi loại chlorophyll Khố lƣợng alkaloid tồn phần (g) Định tính alkaloid cĩ trong dịch A 1 Hexan 0,5081 (-) 2 Toluen 0,5067 (+) 3 Ethyl acetat 0,5013 (+) 4 Dicloromethan 0,4831 (++)
Chú thích: (-) Dung dịch trong suốt
(+) Dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút
(a) (b) (c) (d) Hình 3. 10. Sắc ký đồ dịch dung mơi loại chlorophyll (dịch A)
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích:
(H): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng hexan (T): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng toluen (E): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng ethyl acetat (D): Dịch đƣợc loại chlorophyll bằng dichloromethan
Nhận xét: Khi xét cao alkaloid tồn phần thu đƣợc, các trƣờng hợp đƣợc loại chlorophyll bằng dung mơi hexan và toluen cho lƣợng alkaloid nhiều hơn so với 2 trƣờng hợp cịn lại. Tuy nhiên, khi định tính alkaloid trong phần dịch A, ta thấy chỉ cĩ dịch chiết hexan khơng cho kết tủa với thuốc thử chung alkaloid, cịn 3 dịch cịn lại đều cho kết tủa với thuốc thử chung. Đồng thời trên sắc ký đồ của dịch A, sau khi nhúng thuốc thử Dragendorff, các bản khác đều xuất hiện các vết cho màu cam với thuốc thử, chỉ cĩ dịch hexan là khơng, chứng tỏ trong các dịch toluen, ethyl acetat và dicloromethan cĩ chứa alkaloid. Cĩ nghĩa là alkaloid cĩ thể hịa tan trong các dung mơi này, gây thất thốt lƣợng alkaloid tồn phần. Vậy chọn hexan là dung mơi để loại chlorophyll ở bƣớc 2.
Hình 3. 11. Sắc ký đồ dịch alkaloid tồn phần (dịch B) (a) (b) (c) (d)
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff Chú thích:
3.2.3.3. Khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 (theo hình 2.1)
Thực hiện khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 với 3 dung mơi khác nhau là Chloroform, Ethyl acetat và Dicloromethan. Dung mơi sử dụng ở bƣớc 1 và 2 là các dung mơi khảo sát đƣợc ở 2 mục 3.2.3.1 và 3.2.3.2. Đánh giá kết quả khảo sát dựa trên khối lƣợng cao alkaloid tồn phần thu đƣợc (m2), sắc ký đồ của dịch alkaloid (dịch B) và các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất.
Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3
Stt Dung mơi chiết tách alkaloid base Khố lƣợng alkaloid tồn phần (g)
1 Dichloromethan 0,4895
2 Chloroform 0,4952
3 Ethyl acetat 0,4737
N
(a) (b) (c) (d)
Nhận xét: Lƣợng cao alkaloid tồn phần chiết với dung mơi chloroform cao hơn khi chiết với dung mơi dicloromethan và ethyl acetat. Ngồi ra, chloroform là dung mơi ít hỗn hịa với ethanol nhất, dễ chiết hơn 2 dung mơi cịn lại. Chọn chloroform làm dung mơi chiết ở bƣớc 3.
Nhận xét chung:
Theo kết quả của 3 phần 3.2.3.1, 3.2.3.2 và 3.2.3.3, ta chọn đƣợc các dung mơi nhƣ sau:
- Dung mơi chiết ban đầu: Ethanol 80% - Dung mơi loại chlorophyll: Hexan
- Dung mơi chiết tách alkaloid base từ dịch acid: Chloroform Từ đĩ, ta xây dựng đƣợc quy trình chiết alkaloid đầy đủ nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Ngâm lạnh 50 g dƣợc liệu với ethanol 80% trong thời gian xác định. Rút dịch chiết và cơ bớt dung mơi đến khi thu đƣợc cao lỏng tồn phần. Lọc. - Bƣớc 2: Dịch lọc đƣợc đem đi lắc phân bố với 30 ml dung mơi hexan để loại bỏ chlorophyll. Sau khi lắc với dung mơi sẽ thu đƣợc 2 phần dịch là dịch dung mơi và dịch nƣớc.
- Bƣớc 3: Dịch nƣớc đƣợc acid hĩa với HCl 2%(TT) đến pH 1-2, thử bằng giấy quỳ tím. Sau đĩ, kiềm hĩa bằng dung dịch amoniac (TT) đến khoảng pH 10, thử độ pH bằng giấy quỳ tím. Sau khi đã kiềm hĩa, dung dịch đƣợc lắc với 100 ml dung mơi chiết xuất chloroform. Dịch dung mơi đƣợc thu vào bình định mức 100 ml, thêm chloroform vừa đủ (dịch B).
3.3. Tối ƣu ĩ quy trìn c ết xuất lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn
3.3.1. Xây dựng các thí nghiệm tố ƣu ĩ
Dùng phần mềm Modde 5.0 theo mơ hình D-Optional, ta thiết kế đƣợc 13 thí nghiệm chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đĩ thực hiện lặp lại 3 lần thí nghiệm tại mức độ cơ bản của các yếu tố.
Bảng 3. 7. Các thí nghiệm tối ƣu hĩa đã xây dựng đƣợc Stt Tỷ lệ giữa dung mơ / dƣợc liệu (ml/g) (ml/g) Thời gian
ngâm (giờ) pH kiềm hĩa
Khố lƣợng cao alkaloid tồn phần (g) 1 5:1 18 8 0,5921 2 15:1 18 8 0,3851 3 5:1 30 8 0,5307 4 15:1 30 8 0,4801 5 5:1 18 10 0,5184 6 15:1 18 10 0,3332 7 5:1 30 10 0,4932 8 15:1 30 10 0,4831 9 5:1 18 9 0,5387 10 5:1 24 8 0,5079 11 5:1 24 10 0,5184 12 10:1 18 10 0,4451 13 10:1 24 9 0,4580 14 10:1 24 9 0,4496 15 10:1 24 9 0,4328 16 10:1 24 9 0,4515
3.3.2. Kết quả tố ƣu ĩ
Sau khi triển khai sắc ký lớp mỏng, sắc ký đồ thu đƣợc nhƣ sau:
(c) (d) (a) (b)
(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm
(c) Dƣới sáng sáng UV 365 nm (d) Sau khi phun thuốc thử Dragendorff
Từ các số liệu thực nghiệm, sử dụng phần mềm Modde 5.0, thu đƣợc các thơng số tối ƣu hĩa nhƣ bảng 3.8:
Bảng 3. 8. Kết quả các thơng số đánh giá mơ hình thiết kế tối ƣu hĩa
Thơng số Kết quả
1 Lack of fit (giá trị p) 0,157
2 R2 0,972
3 R2 điều chỉnh 0,930
4 Q2 0,767
5 p của mơ hình > F < 0,001
Từ bảng 3.8, ta thấy hệ số tƣơng quan R2 và R2 hiệu chỉnh của mơ hình này đều lớn hơn 0,9 nên cĩ thể xem rằng mơ hình thiết kế này phù hợp gần với gần 90 % dữ liệu thu đƣợc. Cĩ nghĩa là, gần 90 % biến phụ (3 yếu tố tối ƣu hĩa) đƣợc giải thích bởi biến độc lập (khối lƣợng alkaloid tồn phần).
Hệ số lack–of–fit cĩ ý nghĩa rằng sai số trong phần mềm khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê. Hệ số này phải lớn hơn 0,05 (p > 0,005) thì mới cĩ thể bỏ qua sai số trong hệ thống phần mềm (vì sai số khơng đáng kể). Dựa theo bảng 3.8, hệ số lack- of-fit của mơ hình thiết kế là 0,157, lớn hơn 0,005, vì vậy, ta cĩ thể cho rằng sai số trong hệ thống phần mềm là khơng đáng kể, cĩ thẻ bỏ qua các sai số này.
Nhận thấy, R2 = 0,972 (R2 < 0,995), điều đĩ cho thấy sự tƣơng quan của tỉ lệ dung mơi/dƣợc liệu, thời gian ngâm và pH kiềm hĩa gần nhƣ cĩ ý nghĩa với độ tin cậy 95% (p < 0,05).
Theo nhƣ kết quả thể hiện mức độ ảnh hƣởng của các yếu tố tối ƣu hĩa, ta nhận thấy các yếu tố tỉ lệ dung mơi/dƣợc liệu (X1), thời gian ngâm (X2) và pH kiềm hĩa (X3) đều cĩ ảnh hƣởng đến khối lƣợng alkaloid tồn phần thu đƣợc. Trong đĩ, tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu cĩ ảnh hƣởng lớn nhất, pH kiềm hĩa cĩ ảnh hƣởng ít nhất. Ngồi ra, tƣơng tác giữa tỉ lệ dung mơi/ dƣợc liệu và thời gian ngâm cũng cĩ ảnh