Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa- 123docz.net

2.2.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật

Soi bột: Quan sát bột bằng cảm quan (màu sắc, mùi vị) trƣớc khi soi trên kính hiển vi.

2.2.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu dừa cạn

a. Phương pháp hĩa học

Chuẩn bị mẫu: Lấy 3 g bột dƣợc liệu cho vào một bình nĩn nút mài, làm ẩm bột dƣợc liệu bằng amoniac đậm đặc(TT) trong 30 phút. Thêm 30 ml chloroform (TT), lắc kỹ trong 30 phút, lọc vào bình lắng gạn. Chiết 3 lần bằng dung dịch acid hydrocloric 2 % (TT), mỗi lần với 5 ml, thu đƣợc dịch chiết acid.

Tiến hành thử với các thuốc thử chung alkaloid để xác định sự cĩ mặt của alkaloid.

b. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu:

+ Mẫu chuẩn: Chuẩn bị nhƣ mẫu 2 mục (b) phần 2.2.1.1.

+ Mẫu thử: Chuyển dung dịch acid đã chiết ở phần phản ứng hĩa học cịn lại vào bình gạn, kiềm hĩa bằng amoniac đậm đặc (TT) tới pH 9-10, lắc với

chloroform 2 lần, mỗi lần 5 ml. Gộp dịch chiết chloroform, cơ trên cách thủy đến cịn khoảng 5 ml.

2.2.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn

Quy trình chiết alkaloid cơ bản:

Tiến hành khảo sát các dung mơi thích hợp cần dùng để thu đƣợc quy trình ổn định và phù hợp nhằm chiết xuất alkaloid trong cây Dừa cạn. Các bƣớc tiến hành khảo sát đƣợc tiến hành nhƣ sau:

a. Khảo sát dung mơi chiết ở bước 1 (theo hình 2.1)

Tiến hành khảo sát dung mơi chiết bƣớc 1 theo quy trình chiết với các dung mơi: + Ethanol 50 %

+ Ethanol 80 % + Ethanol 96 %

Các dung mơi dùng ở bƣớc 2 và 3 tùy chọn. Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (m2) và tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid tồn phần thu đƣợc.

Bột dƣợc liệu

Dịch lọc

Dịch nƣớc cịn lại

Dịch chiết dung mơi

- Ngâm lạnh với dung mơi chiết 1 - Cơ thu hồi bớt dung mơi, lọc

- Lắc phân bố với dung mơi 2 để loại chlorophyll.

- Loại bỏ dịch dung mơi

- Chiết với dung mơi 3 Bƣớc 1

Bƣớc 2

Bƣớc 3

b. Khảo sát dung mơi loại chlorophyll ở bước 2 (theo hình 2.1)

Sau khi đã khảo sát xong dung mơi chiết bƣớc 1, chiết alkaloid trong Dừa cạn bằng dung mơi đã chọn, sau đĩ tiến hành khảo sát dung mơi 2 loại chlorophyll theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) với các dung mơi sau:

+ Hexan + Toluen + Ethyl acetat + Dicloromethan

Dùng dung mơi tùy ý để chiết ở bƣớc 3. Ghi nhận lại khối lƣợng tủa (m1) sau khi loại chlorophyll và khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (m2).

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid tồn phần thu đƣợc.

c. Khảo sát dung mơi chiết tách alkaloid base ở bước 3 (theo hình 2.1)

Dùng các dung mơi đã khảo sát đƣợc ở mục (a), (b) và tiến hành khảo sát tiếp dung mơi để chiết tách alkaloid base ở bƣớc 3 theo quy trình chiết cơ bản (hình 2.1) nhƣ trên. Khảo sát dung mơi chiết alkaloid base với các dung mơi sau:

+ Chloroform + Ethyl acetat + Dicloromethan

Ghi nhận lại khối lƣợng cao alkaloid tồn phần (m2) thu đƣợc.

Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng với 3 dịch alkaloid tồn phần thu đƣợc.

2.2.3. Tố ƣu ĩ quy trìn c ết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ Dừa cạn

Từ kết quả nghiên cứu sơ bộ ở trên, ta cĩ thể chọn đƣợc các dung mơi thích hợp để thu đƣợc quy trình chiết alkaloid ổn định và phù hợp. Để chiết xuất đƣợc alakloid từ cây Dừa cạn, ta dùng phƣơng pháp ngâm lạnh, tuy nhiên, hiệu suất của phƣơng pháp này lại phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau nhƣ thời gian chiết xuất,

dung mơi chiết xuất, tỉ lệ dung mơi và dƣợc liệu, nhiệt độ chiết... Vì vậy, tiến hành tìm những điều kiện chiết tối ƣu để thu đƣợc lƣợng alkaloid tồn phần nhiều nhất. Áp dụng phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm với 3 yếu tố độc lập: Tỷ lệ dung mơi và dƣợc liệu, thời gian ngâm lạnh (giờ), pH dùng để kiềm hĩa. Yếu tố phụ thuộc hay thơng số tối ƣu hĩa là khối lƣợng alkaloid tồn phần cân đƣợc (g). Giá trị các yếu tố độc lập và khoảng biến thiên đƣợc trình bày ở bảng 2.4 [7].

Sử dụng phần mềm Modde 5.0 theo mơ hình D-Optional để thiết kế 13 thí nghiệm chọn ngẫu nhiên trong tổng 27 thí nghiệm, sau đĩ thực hiện lặp lại 3 lần thí nghiệm tại mức độ cơ bản của các yếu tố. Thực hiện 16 thí nghiệm đã thiết kế, nhập số liệu thu đƣợc và phân tích kết quả dựa trên các phân tích tốn học của phần mềm Modde 5.0.

Bảng 2. 4. Các yếu tố ảnh hƣởng và mức độ biến đổi

Stt Yếu tố Ký hiệu Mức cơ bản Mức trên (+) Mức dƣới (-) Khoảng biến thiên () 1 Tỷ lệ dung mơi và dƣợc liệu (ml/g) X1 10:1 15:1 5:1 5

2 Thời gian ngâm

lạnh (giờ) X2 24 30 18 6

3 pH dùng để

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Chọn lk lo d để địn ƣớng chiết

3.1.1. Định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 3.1.1.1. P ƣơng p áp ĩ ọc 3.1.1.1. P ƣơng p áp ĩ ọc

Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.1.1, sau đĩ lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml.

- Ống 1 (Ống chứng): Khơng thêm thuốc thử. - Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT).

- Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT).

- Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT).

- Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT).

- Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT).

Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1 (ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.1:

Bảng 3. 1. Kết quả định tính alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng phƣơng pháp hĩa học

Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á

1 Khơng thêm thuốc thử

2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++

3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++

4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng +

5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng +

6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++

Chú thích: (+) dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút

(+++) Cĩ tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2.

Nhận xét: Khi cho thêm các thuốc thử vào, thấy xuất hiện kết tủa và dung dịch bị đục, chứng tỏ trong mẫu thuốc tiêm Cytoblastin cĩ alkaloid.

3.1.1.2. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (b) phần 2.2.1.1 và tiến hành sắc ký với điều kiện: - Bản mỏng: Silica gel F254.

- Dung mơi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1).

- Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.

(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm

Hình 3. 1. Sắc ký đồ định tính alkaloid (vinblastine) trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và dịch chiết ra từ thuốc tiêm (2)

Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng bƣớc sĩng 254 nm, vết vinblastin sulfat trong thuốc tiêm Cytoblastin (1) và vết của dịch chiết từ thuốc tiêm (2) cĩ Rf bằng nhau và hiện màu tím lơ. Đồng thời, sắc ký đồ của 2 dung dịch sau khi phun thuốc thử Dragendorff cho 2 vết màu cam.

3.1.2. Chiết alkaloid trong thuốc tiêm

Thực hiện chiết nhƣ mẫu 2, thu đƣợc dịch chiết alkaloid từ thuốc tiêm.

3.1.3. Xác định khố lƣợng phân tử của chất chiết đƣợc từ thuốc tiêm bằng p ƣơng p áp sắc ký lỏng g ép đầu dị khối phổ (MS )

Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị mẫu nhƣ phần 2.2.1.3. Tiến hành đo khối phổ của mẫu thử bằng hệ ESI-MS/MS (Phƣơng pháp ion hĩa tia điện).

- Thời gian chạy: 1 phút - Năng lƣợng ion hĩa: 70 eV - Tốc độ dịng: 2 ml/ phút

Nhận xét: Sau khi quan sát phổ khối của dịch chiết từ thuốc tiêm Cytoblastin, ta thấy số khối của hoạt chất trong dịch thử là [M] = 811,36 m/z và [M+1] = 812,50 m/z. Phổ khối ESI-MS của chất thử cho pic ion phân tử, ở dạng [M+1] với cƣờng độ khá mạnh, các pic ion phân tử với số khối phù hợp với trọng lƣợng phân tử lý thuyết của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V là M = 811,0 g/mol [1].

Kết luận: Từ kết quả của các mục 3.1.1, 3.1.2 và 3.1.3 cĩ thể khẳng định rằng trong thuốc tiêm Cytoblastin cĩ chứa vinblastin.

3.1.4. Khảo sát cực đại hấp thụ của alkaloid trong thuốc tiêm Cytoblastin 10mg/ 10ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ 10mg/ 10ml bằng p ƣơng p áp qu ng p ổ

Chuẩn bị mẫu nhƣ mục 2.2.1.4. Tiến hành quét phổ để tìm cực đại hấp thụ của vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin, thu đƣợc kết quả nhƣ sau:

- Mẫu 1: Cĩ cực đại hấp thụ tại bƣớc sĩng λ= 258,0 nm, A = 0,327. - Mẫu 2: Cĩ cực đại hấp thụ tại bƣớc sĩng λ= 258,0 nm, A = 0,127.

Nhận xét: Mẫu 3 và mẫu 4 đều cĩ cực đại hấp thụ tại max = 258 nm. Vậy chọn bƣớc sĩng 258 nm để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.

3.1.5. Xây dựng đƣờng chuẩn alkaloid sulfat trong nƣớc

Tiến hành đo độ hấp thụ của các dung dịch đã chuẩn bị ở mục 2.2.1.5 ở bƣớc sĩng 258 nm, kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 3.2:

Bảng 3. 2. Độ hấp thụ của các dung dịch từ mẫu thuốc thử Cytoblastin

Mẫu Nồng độ (g/l) Độ hấp thụ 1 0,0020 0,641 2 0,0018 0,576 3 0,0014 0,441 4 0,0010 0,319 5 0,0008 0,259 6 0,0006 0,197

Trắc nghiệm t: Kiểm tra ý nghĩa của các hệ số a và b theo phƣơng trình hồi quy:

y = 317x + 0,003.

Giả thuyết: H0: Bj = 0 “Hệ số Bj khơng cĩ ý nghĩa thống kê”. HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj cĩ ý nghĩa thống kê”.

- t0,05 (n-2) = 2,77.

- t0 = 0,86 < t0,05 (n-2) = 2,77  chấp nhận H0  hệ số b khơng cĩ ý nghĩa thống kê.

- t0 = 94,39 > t0,05 (n-2) = 2,77  chấp nhận HA  hệ số a cĩ ý nghĩa thống kê.

Trắc nghiệm f: Kiểm tra tính tƣơng thích của phƣơng trình hồi quy.

Giả thuyết H0: Bj = 0 “Phƣơng trình hồi quy khơng tƣơng thích”. HA: Bj ≠ 0 “Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích”.

- f0,05 = 7,71.

- f = 8910,16 > f0,05  chấp nhận HA  phƣơng trình hồi quy tƣơng thích.

y = 317.0x + 0.003 R² = 0.999 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 Độ hấp thu A Nồng độ vinblastine sulfate (g/l)

Hình 3. 5. Đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của vinblastine sulfat

Nhận xét: Kết quả trên cho thấy cĩ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của vinblastin sulfat theo phƣơng trình y = 317x, R2= 0,999 trong khoảng nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006 - 0,002 g/l.

Nhận xét chung:

Ta chiết vinblastin trong thuốc tiêm Cytoblastin bằng cách chuyển vinblastin ở dạng muối thành vinblastin base và dùng dung mơi hữu cơ để chiết vinblastin base ra khỏi dung dịch. Sau khi tiến hành định tính dung dịch thuốc tiêm Cytoblastin và dịch chiết đƣợc từ thuốc tiêm thì kết quả cho thấy cĩ alkaloid trong cả 2 dung dịch. Đồng thời, khi xác định khối lƣợng phân tử của chất đã chiết đƣợc bằng phƣơng pháp MS, ta thấy khối lƣợng phân tử của chất đã chiết tƣơng đƣơng với khối lƣợng phân tử của vinblastin đƣợc ghi nhận tại DĐVN V (M = 811,0 g/mol). Chứng tỏ cĩ alkaloid (định tính vinblastin) trong dịch chiết này.

Khảo sát cực đại hấp thụ của chất đã chiết và vinblastin sulfat trong thuốc tiêm, ta thấy cả 2 mẫu đều cĩ cực đại hấp thụ tại 258 nm. Chọn bƣớc sĩng 258 nm là bƣớc sĩng để đo độ hấp thụ của các dung dịch thử.

Sau khi tiến hành thực nghiệm, ta thấy cĩ sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ của vinblastin sulfat trong mơi trƣờng nƣớc ở khoảng nồng độ vinblastin sulfat từ 0,0006-0,002 g/l.

3.2. Khảo sát các hợp chất alkaloid trong dƣợc liệu Dừa cạn 3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật 3.2.1. Sơ bộ khảo sát thực vật

Bột Dừa cạn tồn cây cĩ màu vàng nhạt, khơng mùi, vị đắng. Các cấu tử đƣợc tìm thấy trong bột dƣợc liệu gồm cĩ: mảnh bần, mảnh mơ mềm cĩ chứa tinh bột, mảnh mạch vịng, mạch xoắn, mạch vạch, lơng che chở đơn bào hay đa bào.

Nhận xét: Bột dƣợc liệu Dừa cạn cĩ các cấu tử đặc trƣng của bột cây Dừa cạn theo DĐVN V [1].

(a) (b)

(e) (f)

(a) Mảnh bần (b) Mảnh mơ mềm cĩ tinh bột (c) Mạch vịng

(d) Mạch xoắn (e) Mạch vạch (f) Lơng che chở đơn bào Hình 3. 6. Soi bột dƣợc liệu Dừa cạn

3.2.2. Địn tín lk lo d trong dƣợc liệu Dừa cạn 3.2.2.1. Phản ứng hĩa học

Chuẩn bị mẫu thử nhƣ mục (a) phần 2.2.2.2, sau đĩ lấy 6 ml dung dịch mẫu cho vào 6 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml.

- Ống 1 (Ống chứng): Khơng thêm thuốc thử. - Ống 2: Thêm 2 giọt thuốc thử Dragendorff (TT).

- Ống 3: Thêm 2 giọt thuốc thử Bouchardat (TT).

- Ống 4: Thêm 2 giọt thuốc thử Bertrand (TT).

- Ống 5: Thêm 2 giọt thuốc thử Valse-Mayer (TT).

- Ống 6: Thêm 2 giọt thuốc thử Hager (TT).

Sau khi cho các thuốc thử chung alkaloid vào các ống nghiệm, so sánh với ống 1 (ống chứng), quan sát thấy các hiện tƣợng nhƣ bảng 3.3:

Bảng 3. 3. Kết quả định tính alkaloid trong bột dƣợc liệu bằng phƣơng pháp hĩa học

Ống Thuốc thử Kết quả Đán g á

1 Khơng thêm thuốc thử

2 Dragendorff Xuất hiện tủa cam +++

3 Bouchardat Xuất hiện tủa nâu ++

4 Bertrand Xuất hiện tủa trắng +

5 Valse-Mayer Xuất hiện tủa trắng ++

6 Hager Xuất hiện tủa vàng +++

Chú thích: (+) Dung dịch đục mờ nhƣng khơng lắng (++) Dung dịch đục, cĩ tủa lắng sau vài phút

(+++) Cĩ tủa lắng ngay. Dung dịch đục sau khi thêm giọt TT thứ 2

Nhận xét: Dịch chiết cho phản ứng dƣơng tính với tất cả các thuốc thử chung alkaloid, điều đĩ chứng tỏ trong mẫu dƣợc liệu cĩ chứa alkaloid.

(a) Dƣới ánh sáng thƣờng (b) Dƣới ánh sáng UV 254 nm

3.2.2.2. Sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị 2 mẫu nhƣ mục (b) phần 2.2.2.2 và tiến hành sắc ký với điều kiện: - Bản mỏng: Silica gel F254.

- Dung mơi khai triển: Chloroform – Methanol (9:1).

- Phát hiện vết bằng UV 254 nm, UV 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.

(a) (b) (c) (d)

Nhận xét: Trong điều kiện sắc ký đã chọn, nhận thấy khi soi bản mỏng ở ánh sáng bƣớc sĩng 254 nm, sắc ký đồ của dịch chiết từ cây Dừa cạn (T) cho vết tƣơng đƣơng với vết trên sắc ký đồ của vinblastin (C). Đồng thời, khi phun thuốc thử

Dragendorff, trên sắc ký đồ của 2 dung dịch cho 2 vết màu cam cĩ cùng Rf.

Nhận xét chung:

Từ kết quả thực nghiệm ở các mục 3.2.2.1, 3.2.2.2 thu đƣợc:

+ Khi thực hiện phản ứng hĩa học, dịch chiết Dừa cạn cho phản ứng dƣơng tính với thuốc thử chung alkaloid, chứng tỏ đƣợc rằng Dừa cạn cĩ chứa các hợp chất alkaloid.

+ Khi tiến hành sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu là vinblastin (đã xác định đƣợc trong mục 3.2.1) thì chứng minh đƣợc rằng trong mẫu dịch chiết Dừa cạn cĩ chứa vinblastin, một vinca alkaloid cĩ trong cây Dừa cạn.

3.2.3. Xây dựng quy trình chiết lk lo d (địn ƣớng vinblastin) từ cây Dừa cạn

3.2.3.1. Khảo sát dung mơi chiết ở bƣớc 1 (theo hình 2.1)

Thực hiện chiết bột Dừa cạn với ethanol 50%, 80% và 96% theo quy trình chiết xuất hình 3.8. Sử dụng dung mơi khảo sát ở bƣớc 2 là Toluen và bƣớc 3 là Chloroform. Đánh giá bằng cách xác định khối lƣợng cao alkaloid tồn phần thu đƣợc (m2), sắc ký đồ của các dịch chiết (dịch B) cũng nhƣ các yếu tố khác ảnh hƣởng đến quy trình chiết xuất. Thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.4:

Triển khai SKLM Bột dƣợc liệu (50 g)

Dịch lọc

Dịch nƣớc cịn lại Dịch dung mơi (A)

- Ngâm lạnh với dung mơi 1

- Rút dịch chiết, cơ bớt dung mơi để đƣợc cao lỏng - Lọc

- Lắc phân bố với dung mơi 2 (10 ml x 3 lần)

- Acid hĩa bằng HCl 2% đến pH = 1-2