3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG NHO
3.2.2. Enzyme Laccase: Công đoạn sunfit hóa
3.2.2.1. Cấu tạo
Laccase: người ta tìm thấy laccase trong giống nho bị nhiễm Botrytis Cinerea (do Botrytis Cinerea sinh tổng hợp ra). Laccase có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa nhiều hợp chất phenolic. Enzyme này bền với SO2 và quá trình xử lý với bentonite không thể tách được hoàn toàn laccase ra khỏi bán thành phẩm. Có thể dùng phương pháp siêu lọc để loại bỏ laccase hoặc dùng phương pháp thanh trùng nhiệt để vô hoạt enzyme.
Laccase được cấu tạo từ các glycoprotein, với phần carbohydrat góp phần tạo nên mức độ ổn định của enzyme. Tất cả các laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng thuộc 3 loại khác nhau nằm ở các vị trí khác nhau của enzyme. Bốn nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2), loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử. Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện tử hấp thụ điện tử và có thể được hoạt hoá khi liên kết với anion mạnh.
Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phân (vùng) chính A, B, C có khối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C.
3.2.2.2. Tính chất
Laccase có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 40 - 60 kDa. Giá trị pH hoạt động tối thích của laccase nằm trong vùng acid và phụ thuộc nhiều vào cơ chất. Khi sử dụng ABTS là cơ chất thì pH tối ưu cho laccase thường là 3. Tuy nhiên, đối với quá trình oxi hoá các hợp chất phenol như DMP, guanial và syringaldazine, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của 9penzyme cao hơn, từ 4.0 - 7.0.
Độ bền pH của các laccase khác nhau khá nhiều, đa phần các laccase bền ở pH 6. Độ bền pH của laccase từ T. versicolor nằm trong dải pH từ 2.5 7 sau một giờ ủ còn trên 50%.
Khoảng nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thường trong khoảng 25 – 300 oC tuỳ vào từng loại cơ chất xúc tác và các loại laccase khác nhau. Với cơ chất là ABTS laccase thường hoạt động trong khoảng 27 – 300 oC, với cơ chất là DMP laccase hoạt
động ở 25 – 300 oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thay đổi trong khoảng 25- 800 oC, một vài loại enzyme có nhiệt độ hoạt động tối thích dưới 350 oC. Nhiệt độ hoạt động tối thích của laccase từ P. ostreatus nằm trong khoảng 25-350 oC.
2.2.2.3 Cơ chế hoạt động
Laccase là enzyme oxy hoá khử có khả năng oxy hoá diphenol và các hợp chất có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất. Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1 (Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở trạng thái khử (Cu+). Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời bốn điện tử từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptit bảo thủ His-Cys-His. Phân tử oxy sau đó oxy hoá laccase dạng khử, tạo thành hợp chất trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước. Tất cả các ion đồng đều đóng vai trò quan trọng trong cơ chế xúc tác của laccase. Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hoá cơ chất. T1 nhận điện tử đầu tiên từ cơ chất, sau đó điện tử này được vận chuyển qua bộ ba acid amin (His-Cys-His) đến vị trí T2/T3. Phân tử oxy sau đó nhận điện tử và bị khử thành nước. Trong công nghệ tổng hợp các hợp chất hay trong các công nghệ khác, thì cơ chế xúc tác có thể xảy ra theo một trong các cơ chế. Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hoá trực tiếp bởi trung tâm hoạt động do bốn nguyên tử đồng đảm nhiệm.