4. Quy trinhd sản xuất rượu Whisky
4.2 Ứng dụng các enzyme sử dụng trong rượu Whisky
4.2.1Enzyme amylase
Amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, y học, thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác, amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glycoside nội phân tử trong các polysaccharides. Enzyme amylase sẽ thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin mạch dài thành glucose,
maltose và dextrin mạch ngắn.
Dựa vào đặc tính và cơ chế tác dụng lên phân tử tinh bột của enzyme amylase, người ta phân biệt chia enzyme amylase thành hai nhóm:
- Endoamylase (enzyme nội phân): gồm α-amylase và nhóm enzyme khử mạch nhánh . - Exoamylase (enzyme ngoại phân): gồm có β-amylase, γ-amylase (glucoamylase).
4.2.1. 1 enzyme αamilase 4.2.1.1.1 Cấu tạo
Enzyme α - amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α - amylase từ loài vi khuẩn Bacillus
macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các enzyme a-amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.
4.2.1.1.2 Tính chất
Điều kiện hoạt động của α - amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α - amylase từ nấm sợi là 4.0 - 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4.5 - 5.8). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.orysee trong vùng 5.6 - 6.2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6.0 - 7.0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau, a-amylase của Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là a-amylase của malt và vi khuẩn B. subtilis. Ở pH = 3.6 và ở 0°C, α - amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α - amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α - amylase của nấm sợi không giảm bao nhiêu. Trong dung dịch α - amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5.0 - 5.5; α - amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thế chịu được pH từ 2.5 - 2.8. Ở 0°C và pH = 2.5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của a-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α - amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C.
Trong dung dịch đệm pH = 4.7, α - amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40°C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 - 85%. Ở 50°C trong 2 giờ , α - amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn.
4.2.1.1.3 Cơ chế tác dụng
Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau. Amylase có khả năng phân cắt các liên kết -1,4 - glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả. Amylase không thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase là quá trình đa giai đoạn
Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh, các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đư ng hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1).
Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucosecolagen cử ngăn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết 1,6 - glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân từ thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường amylase chi thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hoa cao của amylase là tính chất đặc trưng của nó.
Giai đoạn dextrin hóa
Tinh bột → dextrin phân tử lượng thấp.
Giai đoạn đường hóa
Dextrin → tetra và trimaltose → di & monosaccharide. Amylase → oligosacharide → poliglucose.
Maltose → maltotriose → maltotetrose.
4.2.1.2 Enzyme glucoamylase
4.2.1.2.1 Cấu tạo
Glucoamylase I và glucoamylase II. Cả hai dạng glucoamylase đều là những chuổi glyco – protein, trong phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D – galactose, thành phần
carbonhydrate trong phân tử glucoamylase I chiếm khoảng 18%, còn với phân tử glucoamylase II là 10%.
Phân tử carbonhydrate tham gia trong thành phần cấu tạo enzyme glucoamylase đóng vai trò giúp ổn định cấu trúc enzyme. Ngoài ra chúng còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide giúp cho vùng xúc tác trên enzym gần với cơ chất hơn, do đó quá trình thủy phân của enzyme thuận lợi hơn.
Image 11 cấu trúc không gian của Glucoamylase
4.2.1.2.2 Tính chất
Glucoamylase là một exoamylase, còn được gọi là γ-amylase amyloglucosidae, có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột (Shahina Naz, 2002). So với β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của ethylic, acetone, không bền với ion Cu2+, Hg2+… Glucoamylase có trong nấm mốc và một vài loại vi khuẩn, hoạt động tốt ở 500C, hoạt lực tối đa trong vùng pH: 4,5 ÷ 5,5.
4.2.1.2.3 Cơ chế tác đụng
Cơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylopectin Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 và 1,6 glycoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharides, là enzyme ngoại phân (exo enzyme). Enzyme glucoamylase thủy phân polysaccharides từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một nhưng không thủy phân được các dextrin vòng Khi phân cắt phân tử tinh bột, cùng với việc tạo thành phân tử glucose còn có thể tạo thành oligosaccharides, ngoài ra γ-amylase có thể phân cắt cả liên kết α-1,2 và 1,3 glycoside