Phương pháp phân lập các hợp chất từ dịch sinh khối xạ khuẩn

khuẩn

Định danh các chủng xạ khuẩn được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và lên men sinh khối chủng xạ khuẩn được thực hiện bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – ĐHQG Hà Nội.

Tiến hành ly tâm dịch sinh khối xạ khuẩn thu được để tách hai phần nước và cặn tế bào. Phần dịch nước được chiết với ethyl acetate, cô quay dung môi thu được cặn chiết EtOAc. Phần nước còn lại sau khi chiết với ethylacetate được cô quay để thu được cặn chiết nước. Cặn tế bào thu được sau khi ly tâm được ngâm chiết với MeOH hoặc MeOH/H2O, cất loại dung môi thu được cặn chiết từ tế bào (cặn chiết nội bào).

- Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715), RP-18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

- Sắc ký cột (CC)

Hình 2. 1: Sơ đồ phân lập các chất từ các dịch chiết xạ khuẩn Streptomyces alboniger Cặn tế bào Sephadex LH-20 100%MeOH 121CN5.5.2 (32 mg) 4 phân đoạn (121E2.1121E2.4) 121E2.2 (30 mg) Silicagel D:A (9:1 8:2) VTBE.01 (3,7 mg) 5 phân đoạn (121E1121E5) 121E2 (3,4 g) Silicagel H:D (98:2 1:1) Cặn MeOH (121X; 7g) Cặn EtOAC (121E; 6,2g) Cặn nước (121CN; 10,2g) 40L dịch nước

- Chiết với MeOH: H2O = 9 : 1 - Cất loại dung môi

55L VH19-A21

Li tâm

- Chiết với EtOAC (3x24h) - Cất loại dung môi

Sephadex LH-20 100%MeOH Cao tổng (121CN; 17,2 g) Sephadex, MeOH:H2O (9:1) 8 phân đoạn (121CN1121CN8) 121CN5 (521 mg) 5 phân đoạn (121CN5.1121CN5.5) 121CN5.5 (101 mg) 3 phân đoạn (121CN5.5.1121CN5.5.3) Sephadex, MeOH:H2O (9:1) Sephadex, MeOH:H2O (9:1) 121CN.02 (5,6 mg)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Pha đảo RP-18 (30-50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

Dịch nuôi cấy thu được sau khi nhân giống chủng xạ khuẩn VH19- A121 (55 L) được tiến hành ly tâm 10000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Tách riêng dịch nước và cặn tế bào. Phần dịch nước (40 L) được chiết với EtOAc (3 x 4h x 20 L) thu được dịch chiết EtOAC. Gộp các dịch chiết EtOAc và cất loại dung môi thu được cặn chiết EtOAc ký hiệu là 121E (6,2 g).

Phần dịch nước còn lại sau khi chiết với EtOAc được cô quay thu được cặn nước ký hiệu là 121CN (10,2 g).

Phần cặn tế bào được ngâm chiết trong methanol/nước theo tỉ lệ 9:1 (3 x 4h x 1 L), sau đó tiến hành ly tâm 10000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ cặn. Dịch chiết thu được được tiến hành cất loại dung môi thu được cặn chiết methanol ký hiệu là 121X (7,0g).

Cặn chiết EtOAC 121E (6,2 g) được đưa lên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải 100% methanol thu được 5 phân đoạn (121E.1 - 121E.5).

Phân đoạn 121E.2 (30 g) được tiến hành chạy sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 /Axeton (9:1 đến 8:2) thu được chất sạch VTBE.01 (3,7 mg). Khảo sát cặn nước 121CN và cặn chiết methanol 121X bằng sắc ký bản mỏng cho thấy sự giống nhau giữa hai cặn chiết. Gộp hai cặn chiết này thu được 17,2 gam (ký hiệu là 121CN). Cặn chiết 121CN (17,2 g) được đưa lên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là methanol : nước (9:1) thu được 8 phân đoạn (121CN1 đến 121CN8). Phân đoạn 121CN5 (521 mg) được tiến hành chạy sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là methanol/nước (9:1) thu được 5 phân đoạn (121CN.5.1 đến 121CN.5.5). Phân đoạn 121CN5.5 (101 mg) được tiếp tục tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 (Methanol/nước 9:1) thu được 3 phân đoạn (121CN5.4.1-

121CN5.4.3). Phân đoạn 121CN5.4.2 (32 mg) được tinh chế lần nữa trên cột sephadex LH-20 (100% methanol) thu được chất sạch 121CN.02 (5,6 mg).