Hoạt tính kháng VSV kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng VSV kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh hay yếu của các mẫu
thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC (Minium inhibitor concentration – nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (50% inhibitor concentration
– nồng độ ức chế 50%), MBC (Minium bactericidal concentration – nồng độ diệt khuẩn tối thiểu). Đây là phương pháp đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử bằng cách đo độ đục ( turbidity ) của môi trường nuôi cấy tế bào sinh vật, thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC ( nồng độ nhỏ nhất ức chế của chất thử ức chế hoàn toàn sự pát triển của VSV ), MBC ( nồng độ diệt khuẩn ) và IC50 ( nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của VSV ).
Mẫu thô có MIC ≤ 200µg/ml; chất sạch có MIC ≤50 µg/ml được đánh giá là có hoạt tính
Các chủng VSV kiểm định bao gồm những vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người:
- Bacillus subtilis: trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh. - Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. - Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.
Môi trường nuôi cấy
MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud- 2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm men.
Cách tiến hành
Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256 µg/ml và với chất sạch là 128 µg/ml.
Thử hoạt tính
Lấy 10 l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 l dung dịch VSV kiểm định có nồng độ 5.105 CFU/ml, ủ ở 37oC/24h.
Xử lý kết quả
- Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của VSV.
- Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
- Giá trị MBC được xác định bằng số khuẩn lạc trên đĩa thạch.
* Xác định hoạt tính kháng Mycobacterium smegmatic bằng phương pháp khuếch tán KS trên đĩa thạch: Các chủng XK được nuôi trên môi trường thạch YS trong 7 ngày ở 30°C, chủng vi khuẩn Mycobacterium smegmatis
KCTC 9108 được nuôi trên môi trường 219 lỏng (g/L: pepton – 10, cao nấm men – 5, cao malt – 5, casamino acid – 5, cao bò – 2, glycerol – 2, tween 80 – 50 mg, MgSO4.7H2O – 1) ở 30°C trong 24 giờ. Dịch nuôi vi khuẩn được bổ sung vào môi trường 219 thạch đã khử trùng với tỷ lệ 1% và đổ ra đĩa petri. Các thỏi thạch chứa XK có kích thước 5 mm được đặt lên đĩa. Với các mẫu thử hoạt tính là dịch tách chiết thì tiến hành tạo các lỗ trên đĩa thạch kiểm định bằng ống nhựa và nhỏ 50µl mẫu vào các lỗ. Ủ đĩa ở 30°C trong 24 giờ. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch.