+ Phương pháp MTT
Phương pháp thử độ đôc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng gây độc tế bào ở điều kiện in vitro. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann năm 1983 [42]. Sử dụng muối tetrazolium (MTT - (3-(4,5-
dimethylthiazol-2 - yl)- 2, 5 - diphenyltetrazolium)) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào. Vòng tetrazolium của thuốc thử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động. Dưới tác dụng của enzym dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử (20 µl) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml và 2 µg/ml.
Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 µl tế bào vào các giếng của khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để làm đối chứng không có mẫu thử, chỉ có dung môi pha mẫu là DMSO10%.
- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2, trong thời gian 72h.
- Sau 72 giờ, 10µl MTT (nồng độ cuối cùng là 5mg/ml) được cho vào mỗi giếng.
-Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 50µl (DMSO) 100%.
- Giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ.
- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 128 µg/ml; 32µg/ml; 8µg/ml và 2 µg/ml.
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.
Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào được thực hiện bởi Phòng Hóa Sinh Ứng dụng – Viện Hóa học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN