CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN LOÀI CÁC CHỦNG VI NẤM
TUYỂN CHỌN
Việc phân loại các chủng vi nấm tuyển chọn được các nhà khoa học quan tâm vì đây là cơ sở để so sánh với các tài liệu công bố về các hợp chất tự nhiên mới từ vi nấm [166]. Để hướng đến tìm kiếm và thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư cao, chúng tôi tuyển chọn chủng vi nấm dựa trên các tiêu chí bao gồm có hoạt tính gây độc tế bào mạnh, có đặc điểm hình thái đặc trưng và khả năng tiết chất ra môi trường nuôi cấy. Trong số các chủng vi nấm thể hiện hoạt tính gây độc mạnh đối với hai dòng tế bào ung thư gồm ung thư cổ tử cung (Hela) và ung thư vú (MCF-7), 05 chủng vi nấm gồm 1901NT-1.2.2, 1901NT-1.40.2, 1901NT-1.40.4, 1901NT-2.50.2, và 1901NT-2.53.1 có đặc điểm hình thái khuẩn lạc khá đặc trưng, đều có khả năng tiết sắc tố vào môi trường nuôi cấy nên được lựa chọn để tiếp tục xác định đặc điểm vi hình thái và phân loại.
Dựa vào đặc điểm hình thái được mô tả ở Bảng 3.3 cho thấy cả 5 chủng vi nấm tuyển chọn đều thể hiện khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh trên môi trường Sabouraud sau khi thời gian nuôi cấy 5-7 ngày ở 28oC. Năm chủng vi nấm biển tuyển chọn được tiếp tục quan sát hình thái dưới kính hiển vi (ở vật kính 40x) và đối chiếu với các đặc điểm hình thái được mô tả theo sách định tên loài vi nấm của Raper và Thom (1949), Samson và cộng sự (2011), Crous và Groenewald (2015), Stolk và Samson (1972). Kết quả cho thấy hai chủng vi nấm nghiên cứu 1901NT-1.2.2 và 1901NT-1.40.2 có đặc điểm hình thái điển hình của chi Aspergillus bao gồm có bọng hình cầu, bào tử mọc tỏa tròn và cuống sinh bào tử không phân nhánh. Chủng vi nấm 1901NT-2.53.1 được ghi nhận có đặc điểm hình thái điển hình của chi Penicillium với cuống sinh bào tử
phân nhánh (Bảng 3.4). Các chủng vi nấm này cần được tiếp tục phân tích trình tự gen vùng ITS để đưa ra kết luận phân loại chính xác.
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái của 05 chủng vi nấm biển tuyển chọn
T T
Ký hiệu chủng
vi nấm Hình ảnh khuẩn lạc Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
1 1901NT-1.2.2 - Vàng, khuẩn lạc tròn - Tiết sắc tố vàng nhạt - Bề mặt dạng sợi - Viền dạng sợi - Độ dày lồi 2 1901NT-1.40.2 - Màu vàng cam, tròn - Tiết sắc tố màu cam - Bề mặt gồ ghề, có nhiều hạt tròn trên bề mặt - Độ dày phẳng - Viền liền 3 1901NT-1.40.4 - Màu xám, tròn - Tiết sắc tố vàng nhạt - Bề mặt dạng sợi - Viền dạng sợi 4 1901NT-2.50.2 - Màu cam, tròn - Tiết sắc tố cam - Bề mặt mịn, phẳng - Viền liền
5 1901NT-2.53.1 - Màu cam, tròn - Tiết sắc tố vàng - Bề mặt mịn, lồi giữa - Viền liền - Độ dày lồi
Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái của 05 chủng vi nấm biển tuyển chọn được quan sát dưới kính hiển vi
TT Chủng vi nấm Hình thái vi nấm Đặc điểm hình thái vi nấm
1 1901NT-1.2.2 - Bào tử hình cầu, mọc dạng
tỏa tròn
- Bọng hình cầu
- Cuống sinh bào tử có thành dày, bị thóp lại chỗ dưới bọng
2 1901NT- 1.40.2
- Bào tử hình cầu, dạng tỏa tròn
- Thể bình có hai tầng - Bọng hình cầu
- Cuống sinh bào tử có thành xù xì, vách màu nâu
3 1901NT- 1.40.4
- Cuống sinh bào tử phân nhánh
- Khuẩn ty phân nhánh, có thành dày
Bào tử thuôn dài hoặc hình elip
4 1901NT- 2.50.2
- Các sợi nấm phân nhánh, kéo dài và phình to ra thành các túi chứa bào tử bên trong
- Các túi bào tử có hình dạng quả trám
- Bào tử hình dạng tròn
5 1901NT- 2.53.1
- Bào tử nhẵn, ban đầu hình elip, khi già có hình cầu - Cuống sinh bào tử nhẵn,
có vách ngăn mờ, phân nhánh điển hình
Bảng 3.5. Phân loại 05 chủng vi nấm biển dựa trên phân tích trình tự gen vùng ITS
TT Chủng vi
nấm biển Tên loài Tên chủng so sánh
Mã số đăng ký Ngân hàng Gen của chủng so sánh Độ tương đồng 1 1901NT- 1.2.2
Aspergillus sp. Aspergillus chrysellus NRRL 5084 EF652155 733/737 bp (99%)
Aspergillus dimorphicus NRRL 35052 EU021602 733/737 bp (99%)
Aspergillus europaeus CCF 5089 LN909003 733/737 bp (99%)
Aspergillus europaeus CCF 1616 LR983922 727/731 bp (99%)
Aspergillus wentii NRRL 375 EF652151 732/737 bp (99%)
2 1901NT- 1.40.2
Aspergillus subramanianii
Aspergillus subramanianii NRRL 5170 EF661402 720/720 bp (100%)
Aspergillus subramanianii DTO:129-E6 KP329614 604/604 bp (100%)
Aspergillus subramanianii NRRL 6162 NR_135385 566/566 bp (100%)
Aspergillus subramanianii DTO:129-G4 KP329626 603/604 bp (99%)
3 1901NT- 1.40.4
Trichoderma longibrachiatum
Trichoderma longibrachiatum CIB T29 EU280095 631/632 bp (99%)
Trichoderma longibrachiatum QT22040 KY209918 631/632 bp (99%)
Trichoderma longibrachiatum FIS4 KY378946 631/632 bp (99%)
Trichoderma longibrachiatum TL.14 KJ010953 631/632 bp (99%) Trichoderma longibrachiatum MIAE00828 KM225906 631/632 bp (99%) 4 1901NT- 2.50.2
Fusarium sp. ST56 FJ892747 784/811 bp (97%)
Fusarium sp. BBA 69700 AF310976 784/811 bp (97%)
Fusarium sp. CBS 119214 EU552132 779/816 bp (95%)
Fusarium sp. KANPR01 KC119197 763/801 bp (95%)
5 1901NT- 2.53.1
Penicillium sp. Penicillium senticosum CBS 329.71 MH860152 713/721 bp (99%)
Penicillium striatisporum CBS 706.68 MH859205 710/721 bp (98%)
Penicillium terrenum CBS 213.71 MH860072 705/717 bp (98%)
Penicillium erubescens CBS 318.67 MH858982 681/694 bp (98%)
Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại của 05 chủng vi nấm biển tuyển chọn được xây dựng dựa trên trình tự gen vùng ITS theo phương pháp Neighbor
Joining, boostrap 1000 lần bằng phần mềm MEGA7
Các chủng vi nấm tiếp tục được phân loại dựa trên phương pháp phân tích trình tự gen vùng ITS. Kết quả phân tích trình tự gen vùng ITS của 05 chủng vi nấm tuyển chọn được so sánh với các trình tự gen tương ứng của các chủng vi nấm trên ngân hàng gen NCBI sử dụng công cụ BLAST và xây dựng cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng vi nấm 1901NT-1.40.2 có độ tương đồng cao (100%) với các chủng Aspergillus subramanianii NRRL 5170 (EF661402), Aspergillus subramanianii NRRL 6161 (EF661403), Aspergillus subramanianii DTO:129-E6 (KP329614). Chủng 1901NT-1.40.4 tương đồng 99% với các chủng Trichoderma longibrachiatum CIB T29 (EU280095),
Trichoderma longibrachiatum QT22040 (KY209918), Trichoderma longibrachiatum FIS4 (KY378946), Trichoderma longibrachiatum TL.14 (KJ010953), và Trichoderma longibrachiatum MIAE00828 (KM225906). Ba chủng vi nấm 1901NT-1.2.2, 1901NT- 2.50.2 và 1901NT-2.53.1 có độ tương đồng 97-99% lần lượt với các chủng thuộc các chi Aspergillus, Fusarium, và
Penicillium (Bảng 3.5, Hình 3.4).
Từ sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen vùng ITS đã đưa đến kết quả phân loại 05 chủng vi nấm thể hiện hoạt tính kháng ung thư cao được tuyển chọn đều thuộc ngành Ascomycota. Trong đó, có 03 chủng thuộc bộ Eurotiales là Aspergillus sp. 1901NT-1.2.2, Aspergillus subramanianii 1901NT-1.40.2, Penicillium sp. 1901NT-2.53.1; và 02 chủng thuộc bộ Hypocreales là Trichoderma longibrachiatum 1901NT-1.40.4 và
Fusarium sp. 1901NT- 2.50.2.
Theo thống kê các kết quả nghiên cứu, các nhà khoa học đã đưa đến nhận định là việc thu nhận hợp chất tự nhiên mới, đặc biệt là các hợp chất kháng ung thư có liên quan đến phát sinh loài vi nấm biển [46]. Phần lớn các chủng vi nấm biển thuộc các chi Aspergillus và Penicillium được báo cáo có khả năng sinh tổng hợp hiệu quả nhiều nhóm chất kháng ung thư. Theo nghiên cứu đã công bố, 41,7% chủng vi nấm biển phân lập từ hải miên Chelonaplysilla sp. ở đảo Mandeh, Indonesia đã được ghi nhận có hoạt tính gây độc tế bào chống lại tế bào ung thư vú (T47D). Trong số các chủng vi nấm có hoạt tính thì có một số chủng đã được xác định thuộc chi Aspergillus, Penicillium và Phomapsis [65]. Chủng vi nấm Aspergillus ochraceus được phân lập từ hải miên Agelas oroides, Thổ Nhĩ Kỳ cũng được ghi nhận có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào chống lại dòng tế bào ung thư buồng trứng ở người A2780 [167]. Lee và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phát hiện rằng từ cao chiết thô ethyl acetate thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus versicolor có nguồn gốc từ hải miên Petrosia sp. ở đảo Jeju, Hàn Quốc đã được ghi nhận có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thuộc nhóm polyketide có hoạt tính gây độc tế bào đối với năm dòng tế bào ung thư ở người bao gồm ung thư phổi A- 549, ung thư buồng trứng SK-OV-3, ung thư da SK-MEL-2, ung thư thần kinh
trung ương XF-498 và ung thư ruột kết HCT-15 với giá trị IC50 trong khoảng 0,41-4,61 µg/mL [168]. Chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm terpenoid được thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus insuetus OY-207 phân lập từ hải miên
Psammocinia sp. ở Israel cũng được ghi nhận có hoạt tính độc tính tế bào đối với dòng tế bào bệnh bạch cầu ở người MOLT-4 [169]. Năm 2016, Zhao và cộng sự đã công bố rằng chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm sesquiterpene được thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus insulicola MD10-2 phân tập từ hải miên Cinachyrella australiensis ở Biển Đông thể hiện độc tính tế bào chống lại dòng tế bào ung thư phổi H-460 với giá trị IC50 là 6,9 µM [170]. Chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm peptide and polyketide được thu nhận từ chủng vi nấm
Aspergillus terreus SCSIO 41008 phân lập từ hải miên Callyspongia sp. ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc đã được Luo và cộng sự (2019) báo cáo rằng các chất chuyển hóa này có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người HCT-116 [171]. Các cao chiết thô ethyl acetate thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus niger được phân lập từ hải miên Axinella damicornis ở Địa Trung Hải tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó có một số hợp chất được đánh giá có hoạt tính gây độc tính tế bào đối với các dòng tế bào ung thư ở người [172]. Các chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm sesquiterpenoid được phân lập từ chủng vi nấm Aspergillus ustus có nguồn gốc từ hải miên Suberites domuncula ở biển Adriatic được ghi nhận có hoạt tính gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào khối u bao gồm tế bào L5178Y, HeLa và PC12 [173]. Handayani và cộng sự (2017) đã nghiên cứu và phát hiện cao chiết thô ethyl acetate thu nhận từ các chủng vi nấm phân lập từ hải miên
Acanthostrongylophora ingens ở Indonesia được ghi nhận có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thuộc nhóm phenolic, terpenoid và steroid có hoạt tính gây độc tế bào. Trong số các chủng vi nấm có hoạt tính thì có một số chủng đã được xác định thuộc chi Aspergillus [174].
Năm 2020, Wang và cộng sự đã báo cáo Aspergillus candidus
OUCMDZ-1051 được phân lập từ hải miên ở Trung Quốc có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào [175]. Chủng vi nấm
Aspergillus candidus KUFA 0062 có nguồn gốc từ hải miên đã thu nhận hợp chất preussin được chứng minh có tác dụng gây độc tế bào đối với một số dòng
tế bào ung thư vú (MCF7, SKBR3 và MDA-MB-231) [176]. Chủng nấm
Aspergillus insulicola MD10-2 có nguồn gốc từ hải miên Cinachyrella australiensis ở biển Đông cũng được ghi nhận chất chuyển hóa thứ cấp có khả năng sinh tổng hợp chất Insulicolide A thể hiện hoạt tính gây độc tế bào chống lại dòng tế bào ung thư phổi H-460 ở người [177].
Pang và cộng sự (2019) đã chứng minh các chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm alkaloid và polyketide có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư dạ dày ở người MGC803 được thu nhận từ chủng vi nấm
Penicillium sp. SCSIO41015 có ngồn gốc từ hải miên Callyspongia sp., Trung Quốc [178]. Chủng vi nấm Penicillium chrysogenum có nguồn gốc từ hải miên
Ircinia fasciculata ở Địa Trung Hải được ghi nhận sinh tổng hợp chất chuyển hóa thuộc nhóm sorbicillinoid có khả năng gây độc tế bào đối với các tế bào bạch cầu L5178y và tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung HeLa, S3 [179]. Qi và cộng sự (2014) đã nghiên cứu chủng vi nấm Penicillium sp. phân lập từ hải miên có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư HL-60, Hela và K562 với giá trị IC50 lần lượt là 0,78, 4,11 và 7,57 µM [87]. Chủng vi nấm Penicillium canescens phân lập từ hải miên Agelas oroides được ghi nhận có khả năng tạo hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế tào ung thư buồng trứng ở người A2780 [180]. Kossuga và cộng sự (2012) đã đánh giá hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào của 688 chủng vi nấm. Dựa trên kết quả sàng lọc đã tuyển chọn được 5 chủng có hoạt tính sinh học cao, trong đó có 4 chủng thuộc chi Penicillium. Trong số các hợp chất được phân lập, pyrenocine J là một hợp chất mới được phân lập từ loài nấm biển P. paxilli có nguồn gốc từ hải miên M. angulosa [62]. Chất chuyển hóa thứ cấp thứ cấp thuộc nhóm alkaloid được phát hiện trong cao dịch chiết ethyl acetate thu nhận từ chủng vi nấm Penicillium sp. phân lập từ hải miên Axinella verrucosa ở Địa Trung Hải được ghi nhận có hoạt tính gây độc tế bào [181].
Gần đây, nhóm nghiên cứu Salendra và cộng sự (2021) đã phát hiện chủng vi nấm Penicillium citrinum SCSIO 41017 có nguồn gốc từ hải miên
lại dòng tế bào ung thư MCF-7 với giá trị IC50 là 1,3 µM [112]. Chủng vi nấm
Penicillium aurantiogriseum SP0-19 có nguồn gốc từ hải miên được ghi nhận chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm alkaloid có hoạt tính gây độc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư HL-60, P388 và BEL-7402 [82]. Điều tra hóa học về chủng vi nấm Penicillium brocae phân lập từ một loài hải miên Fijian Zyzyya
sp. đã ghi nhận được các chất chuyển hóa thứ cấp thuộc nhóm polyketide mới có tác dụng chống lại dòng tế bào ung thư HCT-116 [182]. Các chất chuyển hóa thứ cấp thu nhận từ chủng vi nấm Penicillium auratiogriseum phân lập từ hải miên Mycale plumose ở Trung Quốc được chứng minh là có tác dụng gây độc tế bào. Điều tra hóa học về chủng vi nấm Penicillium citrinum
SpI080624G1f01phân lập từ hải miên Demospongiae ở đảo Ishigaki, Nhật Bản đã thu thập các hợp chất mới được đánh giá có hoạt tính gây độc tế bào [183]. Chủng vi nấm Penicillium sp. phân lập từ hải miên Ircinia oros ở Địa Trung Hải được báo cáo rằng các chất chuyển hóa thứ cấp có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính chống lại các tế bào ung thư [184]. Các chất chuyển hóa thứ cấp thu nhận từ chủng vi nấm biển P. adametzioides AS-53 có nguồn gốc từ hải miên được ghi nhạn có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thể hiện độc tính tế bào chống lại các dòng tế bào NCI-H446 (IC50 5 µM), A549, DU145, HeLa, HepG2, Huh-7, MCF-7, SGC-7901, SW1990, SW480 và U251 (IC50>10µM) [185].
Thông qua các nghiên cứu đã cho thấy vi nấm phân lập từ hải miên thuộc chi Aspergillus và Penicillium là nguồn vi sinh vật có giá trị để tìm kiếm các hợp chất kháng ung thư mới. Trong điều tra của chúng tôi, trong số các chủng vi nấm có hoạt tính cao được tuyển chọn có đến 03/05 chủng được phân loại thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Cao chiết lên men của các chủng vi nấm này sẽ được tiếp tục phân tích trên GC-MS để dự đoán các nhóm chất chính hiện diện trong cao chiết. Các dịch chiết có chứa các nhóm chất quan tâm sẽ được phân tách, tinh sạch và thu nhận các hợp chất chuyển hóa thứ cấp để tiến hành xác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính kháng ung thư.
Kết quả sàng lọc bước đầu cho thấy rằng các chủng vi nấm phân lập từ hải miên ở vùng biển Nha Trang là nguồn tiềm năng để tiếp tục nghiên cứu tìm
kiếm, thu nhận các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư góp phần bổ sung vào danh mục các hợp chất tự nhiên có giá trị y dược trong nước và trên thế giới.