Chi Lan Kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác
Anoectochilus roxburghii Wall. ex Lindl. Phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh trong
cả nước, được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh, mà bởi giá trị làm thuốc của nó. Lan Kim Tuyến điều kiện tự nhiên đang bị khai thác quá mức, khiến cho loài lan này được liệt kê vào danh sách cần được bảo tồn. Hiện nay, các nghiên cứu ở Việt Nam chủ yếu tập chung ở lĩnh vực nuôi cấy in vitro
và bảo tồn nguồn lan. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cũng như tác dụng dược lý của cây Lan Kim Tuyến hiện nay vẫn còn bỏ ngõ ở Việt Nam. Do vậy, việc nghiên cứu tác dụng dược lý nói chung và tác dụng kháng ung thư nói riêng của cây Lan Kim Tuyến là hoàn toàn cần thiết.
Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan Kim tuyến Anoectochilus formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc. Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K 1g/l + 20N-20P-20K 1g/l) +
2g/l peptone. Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1mg/l BAP (hoặc 1-2mg/l TDZ) + 1% than hoạt tính.
Năm 2010, Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành. Đã đạt được những kết quả bước đầu trong nhân nhanh chồi in vitro loài Lan kim tuyến – Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan kim tuyến in vitro là Knud. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chiều cao chồi từ 2 - 3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường Knud được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l dịch chiết khoai tây + 20 g/l sucrose + 7 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính.
Năm 2010, Phan Ngọc Khoa, Trường Đại học Khoa học Huế đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan Kim tuyến.
Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã nhân nhanh giống lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro nhằm bảo tồn nguồn dược liệu. Kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy, cơ quan vào mẫu tốt nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng với ethanol và hypoclorite 0,01% trong 10 phút cấy trên môi trường Knud. Môi trường thích hợp nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud bổ sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KIN + 0,3 mg/l NAA + 20 g/l sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g/l agar cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu. Môi trường cảm ứng tạo rễ nhằm tạo cây hoàn chỉnh được thực hiện trên môi trường Knud bổ sung 1,0 mg/l NAA + 20 g/l sucrose + 0,5 g/l than hoạt tính + 7 g/l agar với tỷ lệ ra rễ là 100% và có 4,21 rễ/chồi.
Năm 2012, Nguyễn Trung Thành và cộng sự đã nghiên cứu vai trò của môi trường khoáng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chồi loài lan quý (Anoectochilus setaceus Blume) với mục đích tạo ra được nguồn sinh khối lớn loài lan này cung cấp cho thị trường dược liệu. Hai loại môi trường khoáng được khảo sát là MS và Knud. Môi trường cho hệ số nhân chồi cao nhất là MS với số chồi đạt được là 3,5 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 4,4 cm và số lượng lá đạt 7,5 lá trên cây. Vai trò của 6- Benzylaminopurine (BAP) lên hệ số nhân nhanh chồi cũng được khảo sát, nồng
độ BAP thích hợp cho sự nhân nhanh chồi cây lan kim tuyến là 0,6 mg/l trong môi trường MS số chồi đạt được là 3,8 chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi đạt 6,6 cm. Ảnh hưởng tích cực của kinetin lên sự nhân nhanh chồi cây lan kim tuyến cũng được khảo sát, kết quả cho thấy ở nồng độ 1,0 mg/l KIN cho sự nhân nhanh chồi cao nhất với số chồi đạt được là 3,2 chồi/mẫu cấy, chiều cao trung bình chồi đạt 6,1 cm.
Năm 2015, Đỗ Mạnh Cường và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và các điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển cây lan gấm (Anoectochilus setaceus Blume) nuôi cấy in vitro. Sau 2 tháng nuôi cấy, kết quả cho thấy, trên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/l BA, cây có sự sinh trưởng và phát triển tốt nhất với chiều cao chồi, khối lượng tươi, khối lượng khô (6,70 cm; 1,41 g, 0,1751 g tương ứng) và đặc biệt số đốt (6,33 đốt/mẫu) đạt cao nhất so với các nghiệm thức khác. Sau đó, các đốt thân tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l BA kết hợp αNAA ở các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chồi cây lan gấm. Sau 2 tháng nuôi cấy, trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/l BA kết hợp 1,0 mg/l αNAA các chồi có sự sinh trưởng và phát triển tốt (chiều cao chồi: 9,03cm; số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượng tươi: 2,63 g và khối lượng khô: 0,2187 g), hệ rễ phát triển mạnh (số rễ: 7,33 rễ/mẫu; chiều dài rễ: 1,36 cm). Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenol trong mẫu tiết ra nhiều. Để tối ưu hóa môi trường, các điều kiện nuôi cấy: lỏng tĩnh, lỏng lắc, agar, bông gòn đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, các chồi trên môi trường lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ phát triển mạnh và đặc biệt không còn hiện tượng nâu hóa.
Cũng trong năm 2015, Chu Hoàng Hà và cộng sự đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thông qua cảm ứng tạo protocorm like body với mục đích bảo tồn loài lan quý hiếm này. Tỷ lệ cảm ứng PLB đạt 86,25% với nguồn mẫu lớp cắt ngang thể chồi trên môi trường Knudson C. Khả năng tái sinh cây từ PLB đạt tỷ lệ cao nhất trên môi trường Ko (knudson C + 10% nước dừa + 10% dịch chiết khoai tây + 30 g/l saccaroza + 2,7 g/l gelrite), K1 (Ko + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l GA3 + 0,3 mg/l kinetin + 0,1 mg/l NAA,với hiệu suất nhân cây đạt 29,66 cây/cụm PLBs 100%
mẫu cấy hình thành rễ và trung bình tạo 3,2 rễ/chồi, các chồi đạt chiều cao trung bình là 4,57 cm và có 4,21 lá/cây.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Cây Lan Kim Tuyến
Trong luận văn này, mẫu cây Lan Kim Tuyến bao gồm toàn cây thu thập trong rừng tự nhiên và được trồng tại hai khu vực phân bố khác nhau (tại mô hình nuôi trồng cây giống trên địa bàn huyện Kbang, tỉnh Gia Lai và vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc huyện KBang, tỉnh Gia Lai) để định danh và nghiên cứu sự phân bố khác nhau về điều kiện trồng.
Các mẫu cây Lan Kim Tuyến thu nhận được phân loại, định danh tại Phòng thí nghiệm CNSH Thực vật trọng điểm phía Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Viện Sinh học Nhiệt đới. Mẫu nguyên liệu được cắt nhỏ, sấy khô và tán tạo bột mịn. Bột Lan Kim Tuyến được kiểm tra độ ẩm và phân tích sơ bộ về thành phần hóa học.
Địa điểm nghiên cứu và lấy mẫu: tại mô hình nuôi trồng cây giống và vườn Quốc gia Kon Ka Kinh thuộc huyện KBang, tỉnh Gia Lai.
Thời gian lấy mẫu: 2 đợt điều tra vào tháng 3/2019 và tháng 11/2020.
2.1.2. Các dòng tế bào sử dụng
- Dòng tế bào ung thư vú người MCF7 được cung cấp bởi ATCC (Mã số: HTB-22).
-Dòng tế bào ung thư vú người BT474 được cung cấp bởi ATCC (Mã số: HTB-20).
-Dòng nguyên bào sợi người WS1 được cung cấp bởi ATCC (Mã số: CRL-1502).
-Dòng nguyên bào sợi người NHDF được cung cấp bởi TS. Tô Minh Quân, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM.
2.1.3. Các bộ kit sử dụng
-Bộ kit kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma (e-Myco™ plus Mycoplasma PCR Detection Kit, 25237, Intron Biotechnology, Hàn Quốc).
-Bộ kit phân tích apoptosis tế bào (Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit, APOAF-50TST, Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ).
-Bộ kit phân tích sự tăng sinh của tế bào (WST-1 cell proliferation kit, 05015944001, Roche, Thụy Sĩ).
2.1.4. Các môi trường và hóa chất
-Môi trường DMEM/F12 (11320-033, Gibco Life Technologies, Hoa Kỳ).
-Huyết thanh thai bò đã bất hoạt (Fetal Bovine Serum, 10082147, Gibco Life Technologies, Hoa Kỳ).
-Dung dịch Trypsin/EDTA (25200-072, Gibco Life Technologies, Hoa Kỳ).
-Kháng sinh Penicillin-Streptomycin (15140-122, Life Technologies, Hoa Kỳ).
-Dung dịch L-glutamine (G7513, Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ).
-Dung dịch muối sinh lý (Phosphate Buffered Saline, 10010023, Gibco Life Technologies, Hoa Kỳ).
-Dung dịch Crystal Violet (V5265, Sigma Aldrich, Hoa Kỳ) -Dung dịch paraformaldehyde (158127, Sigma Aldrich, Hoa Kỳ)
2.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG 2.2.1. Dụng cụ 2.2.1. Dụng cụ
Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ được sử dụng
TT Tên dụng cụ Hãng sản xuất
1 Đĩa 6 giếng, 24 giếng, 96 giếng Corning 2 Đĩa nuôi tế bào 100 mm Corning 3 Đĩa nuôi cấy chuyển màng (transwell) Corning 4 Bình Flask 25 cm2, 75 cm2 Corning
5 Bình Duran (1000 ml, 500 ml, 250 ml, 100 ml, 50 ml) Schott
7 Micropipette 100-1000 l, 10-100 l, 1-10 l Thermo 8 Pipette aid, Pipette đa kênh Thermo 9 Pipette Pasteur Assistent
10 Đầu tip 1000 l, 100 l, 10 l Watson 11 Eppendorf 1500 l, 500 l Kartell Spa 13 Ống ly tâm (15 ml, 50 ml) Corning
14 Các dụng cụ khác: kéo, parafilm, …
2.2.2. Thiết bị
Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng
TT Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
1 Cân 2 số lẻ Pioneer Mỹ
2 Cân 4 số lẻ Sartorius Đức 3 Tủ lạnh – 20oC Sanyo Nhật 4 Tủ lạnh – 70oC n/a Nhật 5 Máy lọc nước tinh khiết Barnstead Mỹ 6 Máy đọc Elisa Amerchan Anh
7 Máy đo quang Thermo Spectronic Mỹ
8 Tủ sấy FD 240 Binder Đức 9 Tủ Hood TT nhiệt đới Việt Nga Việt Nam
11 Máy cô quay chân không Buchi Đức 12 Máy Flow cytometry
FACSCalibur BD Bioscience Hoa Kỳ
13
Hệ thống đọc đa chức năng Glomax Discover Microplate Readers
Promega Hoa Kỳ
14 Hệ thống kính hiển vi huỳnh
quang (Cytell) GE Healthcare Hoa Kỳ
2.3. PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp thu nhận cao chiết cây Lan Kim Tuyến 2.3.1. Phương pháp thu nhận cao chiết cây Lan Kim Tuyến
Ngâm mẫu bột dược liệu trong hai dung môi khác nhau (ethanol và nước) ở nhiệt độ phòng trong 1-2 ngày. Lọc và loại bỏ dung môi bằng hệ thống cô quay chân không tự động (Buchi, Đức) và thu được cao chiết (cân để xác định khối lượng). Hiệu quả tách chiết (Y, %) được xác định dựa vào tỷ lệ % khối lượng giữa lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm cô quay so với khối lượng mẫu sử dụng.
Cảm quan về thể chất, màu sắc cao và xác định độ ẩm của cao cũng như thực hiện các phản ứng hóa học để định tính các nhóm chất đại diện và định lượng các hợp chất đại diện nhằm chọn dung môi chiết xuất phù hợp.
2.3.2. Phương pháp phân tích sơ bộ các hợp chất trong cao chiết
Các nhóm chất hóa học thường gặp trong cao chiết được định tính bằng các phản ứng hóa học đặc trưng (Bảng 2.3). Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học của mẫu Bột dược liệu bằng quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Bucarest, Rumani) và được cải tiến bởi khoa Dược – Trường ĐH Lạc Hồng.
Bảng 2.3. Các thuốc thử dùng để phân tích sơ bộ thành phần hóa học
Nhóm hợp chất Cách thực hiện Phản ứng dương tính
Carotenoid Carr – Price H2SO4
Xanh chuyển sang đỏ Xanh dương hay xanh lục Alkaloid Thuốc thử chung
alkaloid
Kết tủa
Courmarin Phát quang / kiềm Phát quang mạnh hơn
Antraglycosid NaOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ
Tanin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen (polyphenol)
Anthocyanidin HCl/NaOH Đỏ/Xanh Proanthocyanidin HCl/to Đỏ
Triterpenoid tự do Lierbermann- Burchard
Vòng đỏ nâu tím, lớp trên màu xanh lục
Saponin Lắc mạnh/H2O Bọt bền Acid hữu cơ Tinh thể Na2CO3 Sủi bọt Chất khử TT Fehling Tủa đỏ gạch
Chỉ tiêu đánh giá: Quan sát hiện tượng màu sắc trước và sau phản ứng để ghi nhận có hoặc không có các hợp chất tự nhiên trong cao chiết.
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định theo phương pháp Chang et al. Xây dựng đường chuẩn flavonoid có nồng độ 0; 20; 40; 60; 80 và 100 μg/mL từ dung dịch chuẩn gốc quercetin 1000 μg/mL (bảo quản ngăn mát 20 oC trong 1 tháng). Lần lượt cho 0,5 mL dung dịch quercetin (nồng độ 0; 20; 40; 60; 80 và 100 μg/mL) vào 1,5 mL MeOH và thực hiện phản ứng trong 5 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,1 mL AlCl3 10% trong 6 phút. Cuối cùng, hỗn hợp được thêm vào 0,1 mL CH3COOK 1M và 2,8 mL nước cất, lắc đều rồi để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 45 phút. Tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 415 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid trong các mẫu cao chiết.
Các mẫu cao chiết được tiến hành tương tự như quercetin. Hàm lượng flavonoid tổng được tính theo công thức: F = c x V/m. Trong đó: F: hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g chiết xuất); c: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/mL); V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g).
2.3.4. Phương pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào
Các dòng tế bào ung thư vú MCF7, BT474, nguyên bào sợi người được bảo quản các ống đông lạnh (cryovial). Các ống tế bào được giải đông nhanh ở 37oC trong 2-3 phút. Huyền phù tế bào được chuyển vào ống ly tâm (15 ml) có bổ sung môi trường nuôi cấy DMEM/F12, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Sau đó ly tâm 1500 v/p, loại bỏ dịch nổi và thu lại cặn tế bào ở đáy ống ly tâm. Các dòng tế bào được huyền phù vào môi trường nuôi cấy. Toàn bộ dung dịch tế bào huyền phù được chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 100 mm và nuôi cấy ở 37oC và 5% CO2. Sau 12-24 giờ, môi trường cũ được loại bỏ và môi trường nuôi cấy phục hồi mới với 20% FBS được thay thế. Tế bào tiếp tục được nuôi cấy phục hồi từ 4-7 ngày trước khi chuyển sang giai đoạn tăng sinh.
Tế bào được nuôi cấy tăng sinh với môi trường tăng sinh phù hợp, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Môi trường nuôi cấy tế bào được thay từ 2-3 lần/tuần. Khi tế bào đạt 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, tế bào được cấy chuyển bằng Trypsin/EDTA 0,25% theo tỉ lệ 1:3. Sau đó, tế bào tiếp tục được nuôi cấy tăng sinh và thu nhận khi đạt được lượng tế bào cần thiết. Các dòng tế bào được kiểm tra các thông số như tỉ lệ sống chết, khả năng tăng sinh, sự nhiễm khuẩn, nhiễm mycoplasma trước khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.3.5. Phương pháp xác định độc tính tế bào hay ức chế tăng sinh tế bào in vitro vitro
Để đánh giá khả năng gây độc tế bào, bộ kit WST-1 được sử dụng và tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Ngoài ra, ảnh hưởng của dịch chiết lên hình thái tế bào được kiểm tra khi quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi (Olympus, Nhật). Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng ở mật độ tế bào 5 x 103
tế bào/giếng hoặc 1 x 104 tế bào/giếng (tùy thuộc mỗi dòng tế bào). Sau 8-12 giờ, tế bào bám dính được xử lý với cao tổng hay cao phân đoạn ở các nồng độ khác nhau và được nuôi cấy tiếp trong 24-48 giờ. Nguyên bào sợi được xử lý tương tự và được sử dụng làm đối chứng.