5. Những đóng góp mới của đề tài
2.3.6. Phương pháp phân tích sinh học phân tử
Lựa chọn đoạn gen nghiên cứu: Tham khảo tài liệu của Nguyễn và cs. (2017) [20], Chen và cs. (2021) [19] và kiểm tra các trình tự đã được giải mã trên Genbank, chúng tôi chọn một đoạn gen thuộc hệ gen ty thể cytochrome c oxidase subunit I (COI) để giải trình tự và so sánh.
Tách chiết ADN tổng số: Tinh sạch, tách chiết ADN được thực hiện tại phòng thí nghiệm của phòng Bảo tồn thiên nhiên thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam. Các mẫu cơ hoặc gan được tách chiết ADN tổng số sử dụng bộ Kit Dneasy Blood and Tissue (Qiagen, Đức). Quá trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng PCR được tiến hành với HotStarTaq mastermix (Qiagen). Tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 20 µl bao gồm: 2 µl
mỗi chiều mồi (10pmol/µl), 5 µl H2O, 10 µl Taq, 1-2 µl khuôn (tùy thuộc vào nồng độ AND trong dung dịch cuối cùng sau khi tách chiết). Điều kiện của phản ứng PCR: hoạt hóa Taq polymerase ở 95oC, 15 phút; 35 chu kỳ phản ứng ở 95oC trong 30 giây, 45oC trong 45 giây, 72oC trong 1 phút; bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 5 phút. Đối với các mẫu có lượng AND thấp, sản phẩm của PCR lần 1 sẽ được sử dụng làm khuôn cho sản phẩm PCR lần 2. Cặp mồi sử dụng cho phản ứng nhân dòng đoạn gen COIcó kích thước khoảng 700 bp được sử dụng dựa trên nghiên cứu Chen và cộng sự (2021) [19] có trình tự như sau:
Tên mồi Trình tự
Fish F1 5’-GACCTGTGATMTGAAAACCAYCGTTGT-3’
Fish R1 5’-CTTTGGTTTACAAGAACAATGCTTTA-3’
Bảng 2.2. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống Bungarus
Sản phẩm PCR sau đó được kiểm tra trên Gel Agarose đệm TBE 1% ở 90V trong vòng 30 phút. Đối chứng âm sẽ được sử dụng cho mỗi lần PCR. Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch sử dụng Kit GeneJet PCR Purification (Thermo Fisher Scientific) và gửi đi giải trình tự hai chiều tại phòng thí nghiệm Hệ thống học và tiến hoá động vật, Trường Đại học Kyoto, Nhật Bản. Kết quả giải trình tự được xác thực bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng gen để tiến hành phân tích định loại.