KHÁNG DẠI
1.4 1 Các nghiên cứu trên thế giới
K từ khi đƣợc giới thiệu vào năm 1975, kỹ thuật sắc ký ion đã dần đƣợc phát tri n và trở thành phƣơng pháp phân tích đƣợc ứng dụng trong nhiều l nh vực khác nhau. Đặc biệt, kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng trong tất cả các l nh vực liên quan đến sản xuất các sản ph m dƣợc ph m bao g m mô tả đặc đi m của các chất liệu thuốc, các thành phần ho t chất, tá dƣợc, các thành phần mất ho t tính hoặc các t p chất,... Ngoài ra, kỹ thuật phân tách lo i trừ ion cũng đƣợc ứng dụng trong việc lo i trừ các ion không c lợi trong sản xuất dƣợc ph m [25].
Các mảnh kháng th đƣợc t o ra từ IgG miễn dịch của ngựa đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ chất kháng nọc độc rắn, kháng nọc độc bò c p, các tác nhân kháng uốn ván, kháng b ch hầu, kháng d i,…Các mảnh kháng th F ab 2 đƣợc ƣu tiên sử dụng hơn các IgG hoàn chỉnh nhờ tính đặc hiệu và không c các phản ứng phụ không mong muốn. Năm 2 8, ldon Fernandes và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật sắc ký đ tinh s ch mảnh kháng th F ab 2 IgG kháng d i từ huyết thanh ngựa. Trong nghiên cứu này, F ab 2 đã đƣợc tinh chế bằng hai bƣớc sắc ký kế tiếp với thiết bị môi trƣờng Cellufine A-2 và ProSep-vA Ultra. Kết quả cho thấy, F ab 2 c độ tinh khiết và đ ng nhất cao. F ab 2 tinh khiết đã phản ứng với kháng nguyên bệnh d i trong xét nghiệm điện di và xét nghiệm khuếch tán. F ab 2 tinh khiết c chức năng sinh học và hiệu giá đ t 15 IU ml. Phân tích so sánh độ tinh khiết với F(ab )2 c bán trên thị trƣờng bằng kỹ thuật HPLC và SDS- PAGE cho thấy sản ph m c độ tinh khiết cao hơn [26].
Năm 2 11, Sukanda và cộng sự đã nghiên cứu đ cải tiến sản xuất immunoglobulin kháng d i nhằm tăng cƣờng tính an toàn và hiệu quả của sản ph m. Các nhà khoa học đã đề xuất phƣơng pháp mới sản xuất mảnh kháng th F ab 2 kháng d i từ huyết tƣơng ngựa thô. Đầu tiên, sắc ký ái lực protein G đƣợc sử dụng đ tinh chế IgG từ huyết tƣơng ngựa. Sau đ , quá trình tinh chế F ab )2 đƣợc thực hiện bằng sự kết hợp của kỹ thuật sắc ký ái lực protein
30
và siêu lọc với màng c giới h n trọng lƣợng phân tử 50 kDa. Kết quả cho thấy, việc tinh chế IgG đã đƣợc chứng minh là t o điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân bằng pepsin. So với việc thủy phân trực tiếp huyết tƣơng thô, thủy phân hoàn toàn IgG tinh khiết thành F ab 2 cần lƣợng pepsin ít hơn và thời gian thủy phân ngắn hơn. Thủy phân hoàn toàn IgG tinh khiết thành F ab 2 đã đ t đƣợc tỷ lệ pepsin IgG w w là 5:45 với việc bảo t n cấu trúc và hiệu lực. Quá trình mới c hiệu suất thu h i F(ab )2 đ t 68,9 ± ,6 % và sản ph m F ab 2 c hiệu lực cao [27].
Năm 2 16, Jannan Cui và cộng sự đã đánh giá hiệu quả bảo vệ của IgG huyết thanh miễn dịch và sự thủy phân các mảnh kháng th F ab 2 bằng pepsin từ ngựa miễn dịch với các h t giống virus Tây Sông Nin WNV). Globulin miễn dịch đƣợc kết tủa bằng ammonium sulfate bão hòa và đƣợc thủy phân bởi pepsin. Các mảnh F ab 2 đƣợc tinh chế bằng kỹ thuật sắc ký protein- G. Tính toàn vẹn của các mảnh IgG và F ab 2 đƣợc đánh giá bằng SDS-PAGE. Kết quả nghiên cứu cho thấy, độ tinh khiết của các mảnh kháng th F ab 2 sau sắc ký protein- G cao hơn 93,5% [28].
1.4 2 Các nghiên cứu trong nƣớc
T i Việt Nam, năm 1994 Huynh . Hong và cộng sự đã nghiên cứu các phƣơng pháp tinh s ch immunoglobulin bệnh d i từ huyết thanh ngựa đã đƣợc miễn dịch với vi rút d i dựa trên các nguyên tắc khác nhau và so sánh tác động của chúng đối với năng suất và ho t tính sinh học cuối cùng. Các phƣơng pháp tinh s ch không sử dụng kỹ thuật sắc ký bao g m: kết tủa muối, kết tủa axit caprylic. Các phƣơng pháp sắc ký bao g m: sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự kết hợp của kết tủa amoni sulphate S và sắc ký lọc gel Sephadex t o ra tỷ lệ thu h i sản ph m c ho t tính sinh học và độ tinh khiết cao. Mặc dù kỹ thuật sắc ký ái lực với protein G kết hợp với kết tủa S cũng đ t đƣợc tỷ lệ thu h i tƣơng tự và độ tinh khiết của sản ph m cao hơn đáng k , chi phí cao của quy trình này c th h n chế sử dụng ở các nƣớc đang phát tri n [29].
So với các nghiên cứu trƣớc, nh m Jannan Cui sử dụng gel protein- G đ tinh s ch Fab nhƣng giá thành của gel cao gấp 8 lần gel anion
31
Fractogel® EDM DE E. Mặt khác, nh m nghiên cứu Huynh A. Hong sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex giới h n của phƣơng pháp này giá thành gel cao, tốc độ dòng của cột gel chỉ từ 15 – 8 cm h và lƣợng mẫu n p vào cột chỉ 2-3% th tích gel cho mỗi lần ch y. Trong khi đ sắc ký trao đổi anion Fractogel® EDM DE E tốc độ dòng 2 – 5 cm h và lƣợng mẫu n p vào cột 20 – 100 mg/ml gel. Với tiêu chí giảm chi phí và thời gian trong sản xuất chúng tôi chọn phƣơng pháp sắc ký trao đổi anion Fractogel® EDM DE E đ Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng d i (SAR).
32
CHƢƠNG 2 NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU
2.1. NGUY N VẬT LI U
2 1 1 Nguyên liệu
- Mẫu huyết thanh kháng d i sau giai đo n tinh chế (tinh chế bằng phƣơng pháp Pope cải tiến).
ảng 2 1 Kết quả tiêu chu n chất lƣợng của lô 13.18 R
TT Tiêu chí Lô 13 18/AR
01 Độ tinh s ch % 71.91
02 Hàm lƣợng protein mg ml 108.23
03 Hiệu giá IU ml 509
04 n toàn chung Đ t theo dƣợc đi n Việt Nam V,2 19
05 Chất gây sốt Không đ t ≥ 1.30
C
06 Endotoxin (EU/ml) 16
07 Vô khu n Đ t theo dƣợc đi n Việt Nam V,2019)
2.1.2. Gel sắc ký và sinh phẩm
- Fractogel EMD DEAE (Millipore)
- Huyết thanh kháng vi rút d i Favirab (Sanofi): sử dụng làm mẫu đối chứng. - Lysate (Merck)
- Rabbit Anti-Horse IgG H&L (HRP) - Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)
33
2.1.3 Hóa chất
ảng 2 2 Danh sách h a chất chính dùng trong tinh chế
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất
1 Sodium hydroxide Merck
2 Acid acetic Merck
3 Sodium chloride Merck
4 Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Merck
5 Sodium acetate anhydrous Merck
6 Tris(hydroxymethyl) aminomethane Merck
2.1.4. Thiết bị và dụng cụ
ảng 2 3. Danh sách thiết bị và dụng cụ
STT Tên Hãng sản xuất
1 Máy sắc ký KT PILOT 400 GE Healthcare
2 Máy sắc ký lỏng cao áp Thermo
3 Máy đo OD Thermo
4 Cân phân tích điện tử M- 310 Denver Instroment
5 Cột sắc ký XK 16 2 GE Healthcare
6 Cột sắc ký XK 5 3 GE Healthcare
7 Cột HPLC: MabPacTM SEC-1 Thermo
8 Ống falcon 50 ml Corning-Mỹ
9 Chai thủy tinh 5 lít Trung Quốc
10 Nhiệt kế điện tử Omron
11 Laminar ESI BIO12 NF UV.G.V Pháp
12 Tủ ấm SIMIC Memmert
13 Accu-Jet BIOHIT
14 ộ ngu n điện di Powerpac-basic BIO-RAD
15 Genesys 10S UV-VIS Thermo
34 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU
2.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Nội dung 1: Thiết lập quy trình ở giai đo n tinh s ch bằng sắc ký trao đổi ionvới sản ph m huyết thanh kháng d i tinh chế.
Thiết kế mô hình thực hiện nghiên cứu thiết lập quy trình ở giai đo n tinh s ch bằng sắc ký trao đổi ion
Thử nghiệm dung dịch đệm
Quy mô 14 ml lần thử nghiệm)
- Khảo sát dung dịch đệm:
+ Dung dịch 20mM Acetate + 50mM NaCl + Dung dịch 20mM Phosphate + 50mM NaCl - Tốc độ dòng 2 cm h
- pH 5.7
- Độ dẫn điện 5 – 6 mS/cm - Khả năng bám mẫu 40 mg/ml
- Mỗi giai đo n khảo sát 3 lô thử nghiệm. - Đánh giá 3 tiêu chí:
+ Hiệu suất thu h i
+ Độ tinh s ch: SE-HPLC và SDS-PAGE + Hàm lƣợng protein
- Mục đích: Xác định lo i dung dịch đệm mang l i hiệu suất thu h i và độ tinh s ch cao nhất.
Thử nghiệm khả năng ám mẫu
Quy mô 14 ml lần thử nghiệm)
- Khảo sát khả năng bám mẫu: + 40 mg/ml + 60 mg/ml + 80 mg/ml - Tốc độ dòng 2 cm h - pH 5.7 - Độ dẫn điện 5 – 6 mS/cm - Dung dịch đệm đã chọn ở phần thử nghiệm dung dịch đệm.
35
Đánh giá tiêu chuẩn chất lƣợng
(Sử dụng mẫu thử nghiệm của dung dịch đệm và khả năng bám tối ƣu nhất) - Tiêu chí đánh giá: + Định tính kháng th F ab 2 (Western blot) + Độ tinh s ch (SE-HPLC) + Hàm lƣợng protein + n toàn chung + Chất gây sốt + Endotoxin + Vô khu n + Cảm quan
- Xây dựng tiêu chu n chất lƣợng cơ sở
X y dựng thông số quy trình cần thiết lập - Lo i gel - Dung dịch đệm cân bằng - pH dung dịch - Khả năng bám mẫu - Tốc độ dòng - Độ dẫn điện
- Mỗi giai đo n khảo sát 3 lô thử nghiệm. - Đánh giá 3 tiêu chí:
+ Hiệu suất thu h i
+ Độ tinh s ch: SE-HPLC và SDS-PAGE + Hàm lƣợng protein
- Mục đích: Xác định khả năng bám mẫu tối ƣu nhất mà vẫn đảm bảo hiệu suất thu h i và độ tinh s ch cao nhất.
36
Nội dung 2: Tinh chế thử nghiệm và đánh giá chất lƣợng huyết thanh kháng d i bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion đã thiết lập Mô hình thực hiện tinh chế thử nghiệm theo quy trình mới hoàn thiện
TINH CHẾ THỬ NGHIỆM
5 lô ngẫu nhiên 1 lít lô
Lô 13.18/AR Lô 07.19/AR Lô 08.19/AR Lô 15.19/AR Lô 17.19/AR TINH SẠCH
bằng sắc ký trao đổi anion
LỌC VÔ TRÙNG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG HUYẾT THANH SAU TINH SẠCH THU MẪU 5 lô lần lƣợt là: 1.21 R-SK-TC; 02.21/AR-SK-TC; 03.21/AR-SK-TC; 04.21/AR-SK-TC; 05.21/AR-SK-TC
37
Tinh chế thử nghiệm 5 lô 1 lô = 1 lít huyết thanh Đánh giá chất lƣợng bằng các chỉ tiêu:
- Độ s ch kháng th : bằng phƣơng pháp SE-HPLC và SDS-P GE dựa trên so sánh với mẫu ban đầu
- Độ đặc hiệu: bằng phƣơng pháp Western lot đ xác định kháng th d i huyết thanh ngựa đặc hiệu.
- Hiệu suất thu h i (%)=
- Giới h n t p nhiễm:
+ Endotoxin xác định giảm hơn 7 % so với mẫu ban đầu + Chất gây sốt: đ t tiêu chu n cơ sở
+ n toàn: đ t theo tiêu chu n dƣợc đi n + Vô khu n: đ t theo tiêu chu n dƣợc đi n
2.2.2. Tinh sạch huyết thanh kháng dại
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi anion (Flow-through)
Trong đề tài này chúng tôi chọn phƣơng pháp sắc ký trao đổi anion, phƣơng pháp flow through, sử dụng h t nhựa EMD-DEAE với th tích là 40 mL nh i trong cột XK 16/20 với đƣờng kính 16 mm và chiều cao cột gel là 20 cm với các điều kiện thông số cố định nhƣ sau tốc độ dòng 2 cm h, khả năng bám mẫu vào cột 4 mg ml, độ dẫn điện trong khoảng 5 – 6 mS cm và pH 5.7. Nh m nghiên cứu áp dụng thu mẫu theo phƣơng pháp Flow-through mục đích thu protein mục tiêu đi qua cột và lo i bỏ các t p chất không mong muốn bám vào cột nên chọn pH mẫu là 5.7 thấp hơn đi m đẳng điện pI của kháng th F ab 2. Đối với tốc độ dòng 2 cm h tƣơng đƣơng 6.7 ml phút nh m nghiên cứu thiết lập nhƣ vậy đ rút ngắn thời gian trong quá trình ch y mẫu, đ ng thời không ảnh hƣởng nhiều đến cột sắc ký trong quá trình ch y mẫu vì lo i gel EMD-DEAE ổn định đƣợc áp suất và c độ bền cao và mẫu thu sau khi đánh giá chất lƣợng so sánh với mẫu ban đầu phải đ t tiêu chu n
38
chấp nhận đặt ra. Quá trình ch y máy sắc ký cho mỗi lô tinh s ch đƣợc th hiện qua phổ đ trên màn hình máy tính của từng lo i dung dịch đệm.
Phƣơng pháp Flow-through với pH của mẫu và dung dịch đệm là 5.7, thấp hơn pI của F ab 2 và độ dẫn điện khoảng 5-6 mS/cm với mục đích thu nhập phần tinh s ch qua cột và lo i bỏ các t p chất bám l i trong cột. Đ ng thời tối ƣu quy trình tinh chế bằng cách tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến độ tinh s ch cũng nhƣ hiệu suất thu h i bao g m dung dịch đệm và khả năng bám mẫu.
Tiến hành:
Chu n bị cột gel: Gel Fractogel EMD DEAE đƣợc nh i vào cột XK 16/20 với chiều cao 20 cm và đƣờng kính 16 mm.
MKhảo sát dung dị h ệm
Dựa vào thông tin từ nhà sản xuất, tiến hành khảo sát hai dung dịch đệm thông dụng cho phƣơng pháp anion là đệm acetate và phosphate, đây là các lo i dung dịch đệm đáp ứng yêu cầu nhƣ c độ dẫn điện thấp, ổn định về pH và không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng protein mục tiêu. Cố định các thông số nhƣ pH 5.7, khả năng bám 4 mg mL, độ dẫn điện 5-6 mS/cm. Tiến hành lặp l i 3 lần cho mỗi dung dịch đệm.
39
- Quy trình khảo sát đƣợc mô tả nhƣ sơ đ sau:
Khảo sát hả năng bám
Sau khi xác định đƣợc dung dịch đệm thích hợp, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng bám mẫu của gel. Việc tối ƣu đƣợc tỉ lệ mẫu/gel sẽ giúp tinh s ch đƣợc nhiều mẫu hơn mà vẫn đảm bảo các tiêu chí nhƣ độ tinh s ch và hiệu suất thu h i, từ đ rút ngắn quá trình tinh s ch.
Theo kiến nghị về khả năng bám mẫu của nhà sản xuất, tiến hành khảo sát với 3 tỉ lệ mẫu/gel (mg/mL):40, 60, 80. Cố định các thông số nhƣ pH của dung dịch đệm và mẫu là 5.7, độ dẫn điện 5-6 mS cm. Quy trình tinh chế tƣơng tự phần khảo sát dung dịch đệm. Tiến hành lặp l i 3 lần cho mỗi tỉ lệ bám mẫu.
RỬA CỘT Dung dịch NaOH 0.5M, 3CV TRUNG HÒA Dung dịch 200mM Acetate/ 200mM Phosphate, pH 5.7, 3CV CÂN ẰNG Dung dịch 20mM Acetate + 50 mM NaCl/20mM Phosphate + 50 mM NaCl,
pH 5.7, 3CV NẠP MẪU Khả năng bám 4 mg mL, pH 5.7 Độ dẫn điện 5-6 mS/cm CÂN ẰNG LẠI Dung dịch 20mM Acetate + 50 mM NaCl/20mM Phosphate + 50 mM NaCl,
pH 5.7, 3CV
40 Đánh giá:
Tiến hành phân tích kết quả các khảo sát quy trình tinh chế nhƣ sau: - Định tính bằng điện di SDS-PAGE.
- Đánh giá độ tinh s ch bằng phƣơng pháp SE-HPLC - Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo quang OD - Ki m tra hiệu suất tinh chế (%)= í á
í á
2.2.3. Các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng huyết thanh kháng dại
2.2.3.1. Ph ng pháp WE TERN BLOT [30] Nguyên tắc:
Là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng th protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng t o màu hoặc phát huỳnh quang.Trong Western Blot, một hỗn hợp protein đƣợc phân tách bằng điện di SDS-P GE. Các v ch protein đƣợc chuy n lên màng nitrocellulose và từng v ch protein đƣợc phát hiện bằng cách ngâm màng cellulose với kháng th sơ cấp và thứ cấp c gắn enzyme hoặc đánh dấu ph ng x đặc hiệu cho protein quan tâm.
Tiến hành:
ƣớc 1: Chuyển màng ằng iBlot 2 Dry Blotting system
+ Cân bằng gel trong 2 % EtOH pha trong nƣớc khử ion) trong 5-1 phút. + Ngâm i lot filter paper trong nƣớc cất khử ion.