Nội dung 1: Thiết lập quy trình ở giai đo n tinh s ch bằng sắc ký trao đổi ionvới sản ph m huyết thanh kháng d i tinh chế.
Thiết kế mô hình thực hiện nghiên cứu thiết lập quy trình ở giai đo n tinh s ch bằng sắc ký trao đổi ion
Thử nghiệm dung dịch đệm
Quy mô 14 ml lần thử nghiệm)
- Khảo sát dung dịch đệm:
+ Dung dịch 20mM Acetate + 50mM NaCl + Dung dịch 20mM Phosphate + 50mM NaCl - Tốc độ dòng 2 cm h
- pH 5.7
- Độ dẫn điện 5 – 6 mS/cm - Khả năng bám mẫu 40 mg/ml
- Mỗi giai đo n khảo sát 3 lô thử nghiệm. - Đánh giá 3 tiêu chí:
+ Hiệu suất thu h i
+ Độ tinh s ch: SE-HPLC và SDS-PAGE + Hàm lƣợng protein
- Mục đích: Xác định lo i dung dịch đệm mang l i hiệu suất thu h i và độ tinh s ch cao nhất.
Thử nghiệm khả năng ám mẫu
Quy mô 14 ml lần thử nghiệm)
- Khảo sát khả năng bám mẫu: + 40 mg/ml + 60 mg/ml + 80 mg/ml - Tốc độ dòng 2 cm h - pH 5.7 - Độ dẫn điện 5 – 6 mS/cm - Dung dịch đệm đã chọn ở phần thử nghiệm dung dịch đệm.
35
Đánh giá tiêu chuẩn chất lƣợng
(Sử dụng mẫu thử nghiệm của dung dịch đệm và khả năng bám tối ƣu nhất) - Tiêu chí đánh giá: + Định tính kháng th F ab 2 (Western blot) + Độ tinh s ch (SE-HPLC) + Hàm lƣợng protein + n toàn chung + Chất gây sốt + Endotoxin + Vô khu n + Cảm quan
- Xây dựng tiêu chu n chất lƣợng cơ sở
X y dựng thông số quy trình cần thiết lập - Lo i gel - Dung dịch đệm cân bằng - pH dung dịch - Khả năng bám mẫu - Tốc độ dòng - Độ dẫn điện
- Mỗi giai đo n khảo sát 3 lô thử nghiệm. - Đánh giá 3 tiêu chí:
+ Hiệu suất thu h i
+ Độ tinh s ch: SE-HPLC và SDS-PAGE + Hàm lƣợng protein
- Mục đích: Xác định khả năng bám mẫu tối ƣu nhất mà vẫn đảm bảo hiệu suất thu h i và độ tinh s ch cao nhất.
36
Nội dung 2: Tinh chế thử nghiệm và đánh giá chất lƣợng huyết thanh kháng d i bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion đã thiết lập Mô hình thực hiện tinh chế thử nghiệm theo quy trình mới hoàn thiện
TINH CHẾ THỬ NGHIỆM
5 lô ngẫu nhiên 1 lít lô
Lô 13.18/AR Lô 07.19/AR Lô 08.19/AR Lô 15.19/AR Lô 17.19/AR TINH SẠCH
bằng sắc ký trao đổi anion
LỌC VÔ TRÙNG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG HUYẾT THANH SAU TINH SẠCH THU MẪU 5 lô lần lƣợt là: 1.21 R-SK-TC; 02.21/AR-SK-TC; 03.21/AR-SK-TC; 04.21/AR-SK-TC; 05.21/AR-SK-TC
37
Tinh chế thử nghiệm 5 lô 1 lô = 1 lít huyết thanh Đánh giá chất lƣợng bằng các chỉ tiêu:
- Độ s ch kháng th : bằng phƣơng pháp SE-HPLC và SDS-P GE dựa trên so sánh với mẫu ban đầu
- Độ đặc hiệu: bằng phƣơng pháp Western lot đ xác định kháng th d i huyết thanh ngựa đặc hiệu.
- Hiệu suất thu h i (%)=
- Giới h n t p nhiễm:
+ Endotoxin xác định giảm hơn 7 % so với mẫu ban đầu + Chất gây sốt: đ t tiêu chu n cơ sở
+ n toàn: đ t theo tiêu chu n dƣợc đi n + Vô khu n: đ t theo tiêu chu n dƣợc đi n
2.2.2. Tinh sạch huyết thanh kháng dại
Phƣơng pháp sắc ký trao đổi anion (Flow-through)
Trong đề tài này chúng tôi chọn phƣơng pháp sắc ký trao đổi anion, phƣơng pháp flow through, sử dụng h t nhựa EMD-DEAE với th tích là 40 mL nh i trong cột XK 16/20 với đƣờng kính 16 mm và chiều cao cột gel là 20 cm với các điều kiện thông số cố định nhƣ sau tốc độ dòng 2 cm h, khả năng bám mẫu vào cột 4 mg ml, độ dẫn điện trong khoảng 5 – 6 mS cm và pH 5.7. Nh m nghiên cứu áp dụng thu mẫu theo phƣơng pháp Flow-through mục đích thu protein mục tiêu đi qua cột và lo i bỏ các t p chất không mong muốn bám vào cột nên chọn pH mẫu là 5.7 thấp hơn đi m đẳng điện pI của kháng th F ab 2. Đối với tốc độ dòng 2 cm h tƣơng đƣơng 6.7 ml phút nh m nghiên cứu thiết lập nhƣ vậy đ rút ngắn thời gian trong quá trình ch y mẫu, đ ng thời không ảnh hƣởng nhiều đến cột sắc ký trong quá trình ch y mẫu vì lo i gel EMD-DEAE ổn định đƣợc áp suất và c độ bền cao và mẫu thu sau khi đánh giá chất lƣợng so sánh với mẫu ban đầu phải đ t tiêu chu n
38
chấp nhận đặt ra. Quá trình ch y máy sắc ký cho mỗi lô tinh s ch đƣợc th hiện qua phổ đ trên màn hình máy tính của từng lo i dung dịch đệm.
Phƣơng pháp Flow-through với pH của mẫu và dung dịch đệm là 5.7, thấp hơn pI của F ab 2 và độ dẫn điện khoảng 5-6 mS/cm với mục đích thu nhập phần tinh s ch qua cột và lo i bỏ các t p chất bám l i trong cột. Đ ng thời tối ƣu quy trình tinh chế bằng cách tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến độ tinh s ch cũng nhƣ hiệu suất thu h i bao g m dung dịch đệm và khả năng bám mẫu.
Tiến hành:
Chu n bị cột gel: Gel Fractogel EMD DEAE đƣợc nh i vào cột XK 16/20 với chiều cao 20 cm và đƣờng kính 16 mm.
MKhảo sát dung dị h ệm
Dựa vào thông tin từ nhà sản xuất, tiến hành khảo sát hai dung dịch đệm thông dụng cho phƣơng pháp anion là đệm acetate và phosphate, đây là các lo i dung dịch đệm đáp ứng yêu cầu nhƣ c độ dẫn điện thấp, ổn định về pH và không làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng protein mục tiêu. Cố định các thông số nhƣ pH 5.7, khả năng bám 4 mg mL, độ dẫn điện 5-6 mS/cm. Tiến hành lặp l i 3 lần cho mỗi dung dịch đệm.
39
- Quy trình khảo sát đƣợc mô tả nhƣ sơ đ sau:
Khảo sát hả năng bám
Sau khi xác định đƣợc dung dịch đệm thích hợp, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng bám mẫu của gel. Việc tối ƣu đƣợc tỉ lệ mẫu/gel sẽ giúp tinh s ch đƣợc nhiều mẫu hơn mà vẫn đảm bảo các tiêu chí nhƣ độ tinh s ch và hiệu suất thu h i, từ đ rút ngắn quá trình tinh s ch.
Theo kiến nghị về khả năng bám mẫu của nhà sản xuất, tiến hành khảo sát với 3 tỉ lệ mẫu/gel (mg/mL):40, 60, 80. Cố định các thông số nhƣ pH của dung dịch đệm và mẫu là 5.7, độ dẫn điện 5-6 mS cm. Quy trình tinh chế tƣơng tự phần khảo sát dung dịch đệm. Tiến hành lặp l i 3 lần cho mỗi tỉ lệ bám mẫu.
RỬA CỘT Dung dịch NaOH 0.5M, 3CV TRUNG HÒA Dung dịch 200mM Acetate/ 200mM Phosphate, pH 5.7, 3CV CÂN ẰNG Dung dịch 20mM Acetate + 50 mM NaCl/20mM Phosphate + 50 mM NaCl,
pH 5.7, 3CV NẠP MẪU Khả năng bám 4 mg mL, pH 5.7 Độ dẫn điện 5-6 mS/cm CÂN ẰNG LẠI Dung dịch 20mM Acetate + 50 mM NaCl/20mM Phosphate + 50 mM NaCl,
pH 5.7, 3CV
40 Đánh giá:
Tiến hành phân tích kết quả các khảo sát quy trình tinh chế nhƣ sau: - Định tính bằng điện di SDS-PAGE.
- Đánh giá độ tinh s ch bằng phƣơng pháp SE-HPLC - Định lƣợng protein bằng phƣơng pháp đo quang OD - Ki m tra hiệu suất tinh chế (%)= í á
í á
2.2.3. Các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng huyết thanh kháng dại
2.2.3.1. Ph ng pháp WE TERN BLOT [30] Nguyên tắc:
Là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng th protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng t o màu hoặc phát huỳnh quang.Trong Western Blot, một hỗn hợp protein đƣợc phân tách bằng điện di SDS-P GE. Các v ch protein đƣợc chuy n lên màng nitrocellulose và từng v ch protein đƣợc phát hiện bằng cách ngâm màng cellulose với kháng th sơ cấp và thứ cấp c gắn enzyme hoặc đánh dấu ph ng x đặc hiệu cho protein quan tâm.
Tiến hành:
ƣớc 1: Chuyển màng ằng iBlot 2 Dry Blotting system
+ Cân bằng gel trong 2 % EtOH pha trong nƣớc khử ion) trong 5-1 phút. + Ngâm i lot filter paper trong nƣớc cất khử ion.
+ Đánh dấu 1 g c màng lai.
+ Lắp vào máy chuy n màng theo thứ tự: ottom Stack → gel → filter paper → Top Stack.
41
ƣớc 2: Blocking
+ Cho màng lai vào dung dịch blocking, ủ 4°C qua đêm. c th giữ trong tủ l nh 2-3 ngày đến khi thực hiện lai, nếu muốn bảo quản 1-2 tuần: sau khi block xong giữ màng trong dung dịch rửa, giữ l nh 4°C .
ƣớc 3: Ủ kháng thể sơ cấp
+ Ủ màng với kháng th sơ cấp Rabbit Anti-Horse IgG H&L (HRP)(1:1000) ở 4°C 2 giờ).
+ Rửa màng 3-5 lần bằng dung dịch TBST, mỗi lần 1 phút.
ƣớc 4: Ủ kháng thể thứ cấp
+ Ủ màng với kháng th thứ cấp Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (1:10000), ở nhiệt độ phòng trong 3 -6 phút.
+ Rửa màng 3-5 lần bằng dung dịch TBST, mỗi lần 1 phút.
ƣớc 5: Hiện band
+ Chuy n vào phòng tối.
+ Phủ khắp bề mặt màng lai bằng hỗn hợp 1 ml dung dịch phát quang, đặt 1 tấm bọc thực ph m lên màng, ủ trong 1-5 phút.
+ Lấy tấm bọc thực ph m, nghiên màng đ d n cơ chất dƣ vào 1 g c, thấm s ch cơ chất.
+ Chuy n lên máy đọc tín hiệu. Đánh giá:
Quan sát và định vị các v ch protein dựa trên thang protein so với mẫu ban đầu và mẫu huyết thanh Pháp, Ấn Độ đi kèm. Yêu cầu đặt ra là xuất hiện v ch tƣơng tự mẫu ban đầu và mẫu Pháp, Ấn Độ hay n i cách khác là v ch ở vị trí 110kDa.
42
2.2.3.2.Ph ng pháp iện di SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis) [31]
Nguyên tắc:
Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide sử dụng các lỗ siêu nhỏ của gel và dòng điện ch y qua nhằm kéo theo và phân tách các chuỗi poypeptide c khối lƣợng, độ phức t p khác nhau. Protein c kích thƣớc càng lớn di chuy n càng chậm trên gel và ngƣợc l i. SDS dùng trong phƣơng pháp này giúp tích điện âm cho các gốc amino acid của protein. Nhờ vậy, protein không còn ở tr ng thái gấp cuộn và duỗi dài thành chuỗi polypeptide và di chuy n về cực dƣơng của dòng điện. Khi qua các lỗ gel, các protein phân tách nhau chỉ bởi khối lƣợng (chiều dài, thành phần của chuỗi polypeptide . C hai điều kiện xử lý protein trƣớc khi ch y điện di là không khử và khử. Đối với điều kiện không khử, protein nguyên vẹn và xác định đƣợc khối lƣợng tƣơng ứng với d ng tự nhiên. Đối với điều kiện khử, -mecaptoethanol đƣợc thêm vào nhằm phá vỡ các liên kết disulfide. Trong trƣờng hợp khử hoàn toàn, chuỗi nặng đƣợc phân cắt hoàn toàn với chuỗi nhẹ và trên gel nhận đƣợc hai v ch chính.
Tiến hành:
Mẫu chứa protein mục tiêu đƣợc xử lý điều kiện khử đun n ng 95oC, 5 phút, sau đ làm l nh nhanh -20oC, 5 phút hoặc không khử. Tiếp theo, mẫu đã xử lý đƣợc n p vào giếng trên gel, dòng điện gom mẫu là 7 V trong 20 phút và phân tách là 1 V cho đến khi vệt màu của chất chỉ thị vừa ch y tới cuối gel. Phƣơng pháp nhuộm đƣợc sử dụng đ hi n thị v ch protein là nhuộm b c và nhuộm xanh. Hai phƣơng pháp đều sử dụng các h a chất t o màu bám đặc hiệu các amino acid và đƣợc lựa chọn tùy thuộc vào yêu cầu độ nh y.
Đánh giá:
Khi ch y điện di cùng thang protein, v ch chính của kháng th F ab 2 xuất hiện trên gel khối lƣợng 110kDa).
43
2.2.3.3 Ph ng pháp E-HPLC (size exclusion chromatography)[32] Nguyên tắc:
Phƣơng pháp sắc ký lọc gel dùng đ phân đo n các phần tử trong hỗn hợp theo kích thƣớc. Cột sắc ký g m các h t nhựa c cấu trúc lỗ với đƣờng kính nhất định. Theo nguyên lý, các phân tử nhỏ hơn đƣờng kính lỗ trên h t nhựa sẽ di chuy n bên trong lỗ và không mất đi theo dòng chảy của dung dịch, do đ , thời gian qua cột dài hơn, thời gian lƣu lớn hơn. Và ngƣợc l i, các phân tử c kích thƣớc lớn hơn đƣờng kính lỗ sẽbị rửa trôi theo dòng dung dịch qua các khe giữa các h t nhựa. Do đ , thời gian lƣu của chúng nhỏ hơn. Với kích thƣớc lỗ trên h t nhựa, protein quan tâm, th tích gel và tƣơng quan với thời gian lƣu, phƣơng pháp SE-HPLC c th xác định thời gian lƣu của protein và tỉ lệ phần trăm độ tinh s ch trong hỗn hợp.
Tiến hành:
Cột sử dụng là MAbPac SEC-1 c kích thƣớc 150 mm x 2.1 mm x 5 µm. Pha động là dung dịch kali phosphat , 5 M và natri clorua ,3 M trong nƣớc cất, pH 6,8 với tốc độ dòng ,5 ml min. Ch y sắc ký đ ng thời mẫu thử và mẫu so sánh ở cùng n ng độ.
Đánh giá:
Các đỉnh UV đƣợc bi u diễn trên đ thị. Thời gian lƣu của kháng th F ab 2 ch y cùng lúc mẫu chứng và mẫu thử nghiệm phải trên cùng một kích thƣớc cột sắc ký, cùng dung dịch đệm và cùng các thông số trên một phần mềm nhất định. Phần trăm các t p khối lƣợng cao đƣợc tính toán nhằm đánh giá độ tinh s ch của kháng th F ab 2 so với mẫu ban đầu.
2.2.3.4 Ph ng pháp iểm tr ộ vô huẩn [31] Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này nhằm chứng minh sự vắng mặt của những vi sinh vật sống ngo i sinh trong dƣợc ph m. Nếu mẫu c hiện diện của vi khu n và nấm khi đƣợc thêm vào môi trƣờng giàu dinh dƣỡng và nhiệt độ ủ thích hợp, chúng sẽ tăng sinh nhanh ch ng và phát hiện đƣợc dựa trên độ đục.
44
Phƣơng pháp thực hiện và đánh giá kết quả đƣợc mô tả trong Dƣợc đi n Việt nam V, 2019 , PL 15.
2.2.3.5. Ph ng pháp iểm tr hàm ợng protein bằng ph ng pháp o qu ng [31]
Nguyên tắc:
Trong môi trƣờng kiềm, protein kết hợp với ion Cu+2
t o phức màu xanh protein-Cu. Đ ng thời xảy ra phản ứng khử với phosphomolypdice, phosphostungstic acid trong thuốc thử folin t o thành màu xanh bởi phức protein-Cu và các acid amin vòng thơm, đo quang ở bƣớc s ng 75 nm.
Tiến hành:
- Cho vào mỗi Tube thủy tinh theo thứ tự : 0,10; 0,125; 0,15; 0,175; 0,20 ml dung dịch chu n Protein 1 mg/ml.
- Hút chính xác ,2 ml mẫu thử vào tube thủy tinh thông thƣờng, với huyết thanh pha loãng 1 5 đến 1/100).
- Thêm nƣớc cất hai lần cho đủ th tích 4 ml mỗi tube.
- Cho 2 ml dung dịch đ ng kiềm vào mỗi ống. Lắc đều, đ 1 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thêm ,2 ml dung dich folin ½ v/v). Lắc đều, đ yên 3 phút ở nhiệt độ phòng.
Đánh giá:
Hàm lƣợng protein mg ml đƣợc tính dựa theo đƣờng chu n. Kết quả đƣợc so sánh với mẫu ban đầu đ tính đƣợc mức độ lo i bỏ t p chất sau quá trình tinh s ch.
2.2.3.6 Ph ng pháp ge oth kiểm tra endotoxin[33] Nguyên tắc:
Lysate là một ho t chất đƣợc trích ly từ máu của loài sam bi n (Horseshoe crab). Endotoxin làm ho t h a proenzyme c trong lysate, sự ho t h a này đƣợc xác định bằng sự c mặt của n ng độ endotoxin trong
45
phản ứng. Enzyme ho t h a coagulase liên kết làm đông protein Coagulogen c trong lysate. Khi c sự ho t h a xảy ra sẽ làm cho lysate đông l i (gelation).
Endotoxin
Proenzyme Coagulase
Coagulase
Coagulagen Coagulin Đơn vị endotoxin đƣợc tính theo đơn vị quốc tế (EU/ml ). Tiến hành:
- Pha dung dịch và sinh ph m chu n. - Xác định endotoxin trong nƣớc cất: