3 1 1 Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm
Kết quả quá trình tiến hành thử nghiệm với đối với hai lo i dung dịch đệm đã chọn nhƣ thiết kế nghiên cứu với th tích mẫu ban đầu là 14 ml c n ng độ protein đƣợc đo bằng phƣơng pháp đo quang OD của dung dịch huyết thanh dùng đ thử nghiệm tinh s ch là 108,23 mg/mL thuộc lô 13.18/AR. Th tích dung dịch huyết thanh dựa theo th tích cột và khả năng bám mẫu cần thử nghiệm nhằm đánh giá mức độ tinh s ch của sản ph m sau quá trình tinh s ch so với sản ph m chƣa tinh s ch qua sắc ký trao đổi ion.
Đối với dung dịch đệm cetate, quá trình ch y máy sắc ký tinh s ch của lô 1 S R_SK đƣợc th hiện qua hình 3 1 dƣới đây và hai lô tiếp theo (A2/SAR_SK; A3/SAR_SK đƣợc th hiện ở phần phụ lục 4.
Hình 3 1 Phổ đ ch y máy sắc ký của dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl (lô 1 S R_SK)
49
Áp dụng phƣơng pháp Flowthrough đ thu mẫu, nh m nghiên cứu sẽ thu peak mẫu đầu tiên với bƣớc s ng 28 nm và lo i bỏ các t p bám vào cột sau khi ly giải. Mẫu thu đƣợc của dung dịch đệm Acetate tiến hành ki m tra đánh giá về độ tinh s ch, hàm lƣợng protein và hiệu suất thu h i c kết quả đƣợc th hiện ở bảng 3.1 nhƣ sau:
ảng 3 1 Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl
TT Tiêu chí 20mM Acetate + 50mM NaCl A1/SAR_ SK A2/SAR_ SK A3/SAR_ SK TB
01 Th tích mẫu sau khi
ch y qua sắc ký ml 40 45 47 44
02 Hiệu giá sau ch y qua
sắc ký IU/ml) 151.3 120.2 111.45 127.65 03 Hiệu suất thu h i (%) 84.93 75.90 73.51 78.11
04 N ng độ protein (mg/
ml) 13.89 10.33 10.53 11.58
05 Độ tinh s ch % 98.58 98.36 98.65 98.53
06
Tỷ lệ hàm lƣợng protein thu đƣợc so với mẫu ban đầu %
36.67 30.68 32.66 33.34
07 Hàm lƣợng protein đã
lo i bỏ % 63.38 69.32 67.34 66.68 Đối với dung dịch đệm Phosphate, quá trình ch y máy sắc ký của lô P1/SAR_SK đƣợc th hiện qua hình 3 2 dƣới đây và hai lô tiếp theo (P2/SAR_SK; P3/SAR_SK đƣợc th hiện ở phần phụ lục 4.
50
Hình 3 2 Phổ đ ch y máy sắc ký của dung dịch đệm 20mM Phosphate + 50mM NaCl (lô P1 S R_SK)
Tƣơng tự nhƣ cách thu mẫu theo phƣơng pháp Flowthrough ở dung dịch cetate thì nh m nghiên cứu cũng sẽ thu peak mẫu đầu tiên ở bƣớc s ng 280 nm và lo i bỏ các t p bám vào cột sau khi ly giải. Mẫu thu đƣợc của dung dịch đệm Phosphate tiến hành ki m tra đánh giá về độ tinh s ch, hàm lƣợng protein và hiệu suất thu h i c kết quả đƣợc th hiện ở bảng 3.2 nhƣ sau:
51
ảng 3 2 Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Phosphate + 50mM NaCl TT Tiêu chí 20mM Phosphate + 50mM NaCl P1/SAR_ SK P2/SAR_ SK P3/SAR_ SK TB
01 Th tích mẫu sau khi ch y
qua sắc ký ml 45 50 48 47.67
02 Hiệu giá sau ch y qua sắc
ký IU/ml) 96.14 91.26 89.01 92.14
03 Hiệu suất thu h i (%) 61.47 62.45 60.71 61.54
04 N ng độ protein (mg/ ml) 10.93 7.34 16.42 11.56
05 Độ tinh s ch % 98.64 98.33 98.36 98.44
06
Tỷ lệ hàm lƣợng protein thu đƣợc so với mẫu ban đầu %
32.46 24.22 52.02 36.23
07 Hàm lƣợng protein đã lo i
bỏ % 67.54 75.78 47.98 63.77
Dựa vào ảng 3 1 và ảng 3 2 ta thấy hiệu suất thu h i trung bình của dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl là 78.11% và đối với dung dịch đệm 20mM Phosphate + 50mM NaCl là 61.54% so với mẫu ban đầu.
Nhƣ vậy, từ hiệu suất 100% từ mẫu ban đầu sau khi ch y qua cột sắc ký thì lƣợng protein mục tiêu cũng hao hụt theo với dung dịch đệm cetate thì hao hụt 21.89% còn với dung dịch đệm Phosphate thì hao hụt lên đến
39.46%, hiệu suất giảm sau quá trình tinh s ch c th do protein mục tiêu trong quá trình tinh chế khi cắt mảnh Fc chƣa hết hoàn toàn dẫn đến việc mẫu bám l i trong cột cùng với t p chất. Đối với dung dịch đệm cetate c th tối
52
ƣu hơn dung dịch đệm Phosphate nên hiệu suất thu h i từ kết quả trên cho thấy dung dịch đệm Acetate thu h i mẫu cao hơn qua 3 lô ch y thử nghiệm của từng lo i đệm.
Về chỉ tiêu độ tinh s ch của sản ph m sau sắc ký: Phổ đ trên HPLC cho thấy sản ph m sau sắc ký c độ tinh s ch rất cao. Cả hai dung dịch đệm đều lo i bỏ đƣợc các peak t p không mong muốn so với mẫu ban đầu ở các thời gian lƣu lần lƣợt là 13.56; 14.76; 16. 6; 19.37; 2 . 2 và thu h i đƣợc peak mẫu kháng th F ab 2cả 3 lô thử nghiệm đều cho kết quả gần nhƣ nhau, đ t trên 98% và vẫn còn xuất hiện 2 vị trí peak ở thời gian lƣu khác nhau nhƣng tỷ lệ không đáng k <2% và không khác nhau về mặt ý ngh a thống kê.
Nhƣ vậy, trong quá trình tinh s ch thì mẫu thu của cả 2 lo i dung dịch đệm đều chứa protein mục tiêu chiếm tỷ lệ trên 98% so với mẫu ban đầu th hiện ở cùng thời gian lƣu mẫu. Độ tinh s ch sản ph m sau tinh s ch cao hơn so với mẫu ban đầu là 71.91% nhƣ hình 3 3 khi ch y bằng phƣơng pháp SE-HPLC.
Hình 3 3. Kết quả ki m tra độ s ch kháng th lô 13.18 R M Đ bằng phƣơng pháp SE-HPLC
53
Hình 3 4. Kết quả ki m tra độ s ch kháng th của huyết thanh kháng d i chứa dung dịch đệm cetate lô 1 S R_SK bằng phƣơng pháp SE-HPLC
Hình 3 5. Kết quả ki m tra độ s ch kháng th của huyết thanh kháng d i chứa dung dịch đệm phosphate lô P1 S R_SK bằng phƣơng pháp SE-HPLC
54
Kết quả ki m tra bằng phƣơng pháp SDS-PAGE cho thấy các v ch protein của mẫu nằm ở vị trí tƣơng ứng với v ch của Marker và xuất hiện band protein mục tiêu ở khối lƣợng 110 kDa trên bản gel. Nhìn vào hình 3 6, các mẫu thu của 2 lo i dung dịch đệm đều xuất hiện band ở khối lƣợng 11 kDa cùng với mẫu ban đầu và đã mất 1 band c trọng lƣợng lớn hơn 24 kDa và các band mờ khác so với mẫu ban đầu. Tuy nhiên, vẫn còn xuất hiện 1 band mờ c khối lƣợng lớn 110 kDa và 1 band thấp hơn 11 kDa so với mẫu ban đầu thì 2 band này đậm hơn, ngh a là trong quá trình tinh s ch cũng đã giảm đi 1 phần 2 band này so với mẫu ban đầu nhƣng 2 band này không c khối lƣợng cụ th so với bảng marker. Cho nên trong kết quả độ tinh s ch bằng phƣơng pháp SE-HPLC vẫn th hiện 2 band này tƣơng đƣơng với 2 peak ở thời gian lƣu 17.3 và 23.93, nhƣng chiếm tỷ lệ rất thấp là <2%.
1 2 3 4 5 6 7 8 240 140 110 75 50 40 1. Mẫu 1 – Marker 2. Mẫu 2 – A1/SAR_SK 3. Mẫu 3 – A2/SAR_SK 4. Mẫu 4 – A3/SAR_SK 5. Mẫu 5 – P1/SAR_SK 6. Mẫu 6 – P2/SAR_SK 7. Mẫu 7 – P3/SAR_SK 8. Mẫu 8 – Mẫu lô 13.18 R M Đ
Hình 3 6 Kết quả điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch của 2 lo i dung dịch đệm sau các lần thử nghiệm so với mẫu ban đầu và mẫu thô
Vì vậy, đ chọn dung dịch đệm phù hợp với sản ph m huyết thanh kháng d i sau tinh s ch cho hiệu suất thu h i tốt nhất thì nh m nghiên cứu
55
chọn dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl đ tiến hành tiếp tục thử nghiệm tiếp theo đ khảo sát khả năng bám mẫu tốt nhất.
3 1 2 Kết quả thử nghiệm khả năng ám mẫu
Nh m nghiên cứu tiến hành khảo sát khả năng bám mẫu lần lƣợt là 40 mg/ml; 60 mg/ml; 8 mg ml với dung dịch đệm đã chọn là 2 mM cetate + 5 mM NaCl và chọn ra khả năng bám mẫu nào cho độ tinh s ch cao nhất mà rút ngắn đƣợc thời gian ngắn nhất và số lƣợng mẫu n p vào cột cao nhất. Tiến hành thử nghiệm nhƣ đã mô tả ở trên phần phƣơng pháp và sử dụng th tích gel EMD-DEAE sử dụng là 40 mL nh i trong cột XK 16/20 với chiều cao cột gel là 20 cm. Các điều kiện thông số cố định nhƣ sau tốc độ dòng 2 cm h, độ dẫn điện trong khoảng 5 – 6 mS/cm và pH 5.7. Kết quả thử nghiệm khả năng bám mẫu 4 mg ml đã đƣợc thực hiện ở phần khảo sát dung dịch đệm và th hiện l i ở bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng bám mẫu 6 mg ml và 80 mg/ml nhƣ bảng 3 4 ảng 3 5. TT Tiêu chí Lô TB A40.01/SA R_SK A40.02/SAR _SK A40.03/SAR _SK 01 Th tích ban đầu ml 14 ml 02 Th tích sau tinh s ch (ml) 40 45 47 44
03 Hiệu giá sau tinh s ch
(IU/ml) 151.3 120.2 111.45 127.65
04 Hiệu suất thu h i (%) 84.93 75.90 73.51 78.11
56
ảng 3 4 Kết quả khả năng bám mẫu vào cột với n ng độ protein 6 mg ml của 3 lô thử nghiệm
TT Tiêu chí Lô TB A60.01/SAR _SK A60.02/SAR _SK A60.03/SAR _SK 01 Th tích ban đầu ml 22 ml 02 Th tích sau tinh s ch (ml) 70 72 70 70.67
03 Hiệu giá sau tinh
s ch IU ml 121.4 123.1 118.8 121.1 04 Hiệu suất thu h i (%) 75.89 79.15 74.26 76.43
05 Độ tinh s ch % 98.96 98.61 98.79 98.79 ảng 3 5 Kết quả khả năng bám mẫu vào cột với n ng độ protein 8 mg ml
của 3 lô thử nghiệm
TT Tiêu chí Lô TB A80.01/SAR _SK A80.02/SAR _SK A80.03/SAR _SK 01 Th tích ban đầu ml 29 ml 02 Th tích sau tinh s ch (ml) 90 87 92 89.67
03 Hiệu giá sau tinh
s ch IU ml 120.7 124.6 121.1 122.13 04 Hiệu suất thu h i (%) 73.59 73.44 75.48 74.17
57 1 2 3 4 5 240 140 110 75 50 40 1. Mẫu 1 – Marker 2. Mẫu 2 – A40.01/SAR_SK 3. Mẫu 3 – A60.01/SAR_SK 4. Mẫu 4 – A80.01/SAR_SK 5. Mẫu 5 – Mẫu lô 13.18 R M Đ
Hình 3 7 Kết quả điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch của 3 khả năng bám mẫu trên cùng 1 dung dịch đệm cetate
Với kết quả nhƣ ảng 3 3 ảng 3 4 ảng 3 5 thì tất cả khả năng bám mẫu 4 mg ml; 6 mg ml; 8 mg ml đều c kết quả về độ tinh s ch không chênh lệch nhau nhiều và đều lớn hơn 97%. Sản ph m sau sắc ký đã lo i đƣợc các peak protein t p chất không mong muốn so với mẫu ban đầu. C th thấy với các khảo sát độ bám tăng dần lên 6 mg ml và 8 mg ml thì cột gel EMD- DEAE vẫn đảm bảo về lƣợng n p mẫu lên cột và đều đ t hiệu suất thu h i trên 7 %. Nhƣ vậy, đ ch y đƣợc số lƣợng mẫu nhiều và rút ngắn đƣợc thời gian trong quá trình tinh s ch thì nh m nghiên cứu sẽ chọn khả năng bám mẫu là 8 mg ml đ thiết lập quy trình tinh s ch cho các thử nghiệm sau.
Hình 3 7 cho thấy ở mẫu 3; mẫu 4; mẫu 5 đều xuất hiện band protein mục tiêu mảnh F ab 2) với trọng lƣợng 11 kDa cùng với band marker và band mẫu ban đầu trên cùng bảng gel. Cả 3 mẫu thu của 3 khả năng bám đều lo i đƣợc band lớn c trọng lƣợng lớn hơn 24 kDa của mẫu ban đầu.
58
3 1 3 Đánh giá chất lƣợng huyết thanh SAR sau khi tinh sạch ằng sắc ký trao đổi ion và x y dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cơ sở
3 1 3 1 Đánh giá h t ợng huy t th nh R s u hi tinh s h bằng s tr o i ion
Sản ph m huyết thanh S R của các lô tinh s ch của dung dịch đệm cetate và khả năng bám mẫu là 8 mg ml trong đệm bảo quản đƣợc trữ ở 2 – 8oC và trích một phần th tích đ đánh giá chất lƣợng. Các kết quả chỉ tiêu ki m tra đánh giá cơ bản g m các tiêu chí sau:
Kết quả đánh giá độ đặc hiệu: Dựa theo kết quả trên tiêu bản ch y Western blot cho thấy kháng th F ab 2 của ngựa dựa trên khả năng bắt kháng th đặc hiệu. Mẫu c xuất hiện protein mục tiêu mảnh F ab 2).
1 2 3 4 240 140 110 75 50 1. Mẫu 1 – Marker 2. Mẫu 2 – A80.01/SAR_SK 3. Mẫu 3 – A80.02/SAR_SK 4. Mẫu 4 – A80.03/SAR_SK
Hình 3 8. Kết quả định tính kháng th F ab 2 của ngựa
Với kết quả nhƣ hình 3 8, mẫu thu của dung dịch đệm cetate và các khả năng bám mẫu đều th hiện band kháng th F ab 2d i của ngựa đặc hiệu khi sử dụng phƣơng pháp Western blot.
Về chỉ tiêu độ tinh s ch: huyết thanh kháng d i F ab 2 đƣợc đánh giá về độ tinh s ch dựa trên mức độ lo i bỏ protein t p trong sản ph m mà qui trình cũ chƣa lo i bỏ hết. Dựa trên kết quả đánh giá của nội dung 1 thì tất cả các mẫu sau tinh s ch đều đ t độ tinh s ch > 97% so với mẫu ban đầu. Đ ng
59
thời, hàm lƣợng protein cũng giảm xuống đáng k so với n ng độ mẫu ban đầu. Kết quả độ tinh s chcủa 3 lô tinh chế đƣợc trình bày trong hình 3 9, hình 3.10, hình 3 11.
Hình 3 9. Kết quả độ tinh s ch của lô 8 . 1 S R_SK
60
Hình 3 11. Kết quả độ tinh s ch của lô 8 . 3 S R_SK
ảng 3 6 Kết quả hàm lƣợng protein sau sắc ký của 3 mẫu
TT Lô Th tích ban đầu (ml) N ng độ mẫu ban đầu (mg/ml) Th tích sau sắc ký (ml) N ng độ mẫu sau sắc ký (mg/ml) Tỷ lệ thu h i hàm lƣợng protein (%) Tỷ lệ lo i trừ hàm lƣợng protein (%) 1 A80.01/SAR_SK 29 108.23 90 7.91 22.68 77.32 2 A80.02/SAR_SK 87 10.54 29.22 70.78 3 A80.03/SAR_SK 92 9.06 26.56 73.44
61
Phổ đ sau khi phân tích bằng SE-HPLC (Hình 3 3; Hình 3 9; Hình 3.10; Hình 3 11) cho thấy trong dung dịch mẫu ban đầu peak mẫu kháng th c độ tinh s ch là 71.91% và các peak t p chiếm 29. 9%. Các peak t p củamẫu ban đầu lần lƣợt là 1; 2; 3; 5; 6 đều đƣợc lo i bỏ gần nhƣ hoàn toàn sau khi thực hiện thử nghiệm của cả 3 lô tinh s ch ở khả năng bám mẫu 80 mg/ml. Mẫu thu sản ph m của cả 3 lô ch y thử nghiệm tinh s ch chỉ còn đúng peak mẫu ở thời gian lƣu 18 phút c độ tinh s ch đ t trên 99% và 1 peak t p c trọng lƣợng lớn hơn trọng lƣợng kháng th chiếm < 2% trong tổng số dung dịch thu đƣợc. Hiệu suất thu h i trên 7 %, đ ng thời, các lần lặp l i độc lập không c sự khác biệt theo ý ngh a thống kê. Kết quả bảng 3.6, cho thấy với th tích ban đầu là 29 ml và n ng độ protein là 1 8.23 mg ml sau khi ch y qua quá trình tinh s ch đã lo i bỏ t p chất không mong muốn, đ ng ngh a với hàm lƣợng protein cũng giảm theo. Kết quả th tích tƣơng ứng với hàm lƣợng protein sau sắc ký của 3 lô 8 . 1/SAR_SK; A80.02/SAR_SK; A80.03/SAR_SK lần lƣợt là 90 ml và 7,91 mg ml; 87 ml và 1 ,54 mg ml; 92 ml và 9, 6 mg ml. Nhƣ vậy tỷ lệ protein sau tinh s ch đƣợc giảm hơn một nửa so mới hàm lƣợng protein ban đầu trƣớc khi tinh s ch. Với giá trị này c th đề xuất hàm lƣợng protein của huyết thanh S R sau tinh s ch bằng phƣơng pháp sắc ký sẽ nằm trong khoảng 20-30 mg/ml, cho tiêu chu n chất lƣợng cơ sở. Lƣợng protein trong mẫu sau tinh s ch đƣợc coi nhƣ hoàn toàn là protein đặc hiệu, tức là protein của mảnh F(ab')2.
Chỉ tiêu an toàn chung: Tất cả các mẫu của 3 lô sau tinh s ch đƣợc ki m tra an toàn không đặc hiệu. Kết quả cho thấy tất cả chuột thử nghiệm đều sống, khỏe m nh và tăng cân trong suốt thời kỳ theo dõi. Đ t tiêu chu n an