Các phƣơng pháp sinh học phân tử

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN- CTAB

Lấy mẫu lá ngô để kiểm tra chỉ thị phân tử ở giai đoạn thời kỳ 3-6 lá , cắt 2 lá non/cây ở các cá thể ở mỗi tổ hợp lai.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp có sử dụng CTAB có cải tiến để tiến hành tách chiết ADN từ các dòng BC

1. Cắt 2 cm2 mẫu lá cho vào ống eppendoft 2ml đã có bi và viết ống đầy đủ.

2. Thêm 100 µl dung dịch buffer CTAB, nghiền mẫu ở 26000 vòng/ 1,5p, đổi chiều khay nghiên mẫu để nghiền lại lần 2.

3. Thêm 700 µl dung dịch CTAB 4% và 60µl SDS 10% vào mỗi ống eppendoft 2ml vừa nghiền xong, chú ý không đƣợc để đầu pipet chạm vào thành ông, đóng nắp ống và lắc đều.

4. Ủ mẫu ở 65 độ C trong 20 phút.

5. Bổ sung 800 µl chlorofom vào ống mẫu trong tủ hút.

6. Đóng nắp ống, lắc đều sau đó cho vào ly tâm 13000 rmp trong 15 phút. 7. Lấy ống ra khỏi máy ly tâm, lúc này ống chia tành 3 lớp, dịch trên cùng trong suốt màu hơi xanh hoặc vàng, ở giữa là lớp bã lá, cuối cùng là chlorofom có màu xanh đậm. Hút 400 µl dịch tách trên cùng cho vào ống eppendoft 1,5 µl đã bổ sung 400 µl isopropanol.

8. Lắc đều ống, ủ mẫu trong tủ lạnh -40 C ít nhất 1 giờ đồng hồ. 9. Lấy mẫu ra từ tủ lạnh, lắc đều, ly tâm 13000 rpm trong 15 phút. 10.Đổ bỏ dịch bên trên, giữ lại kết tủa ở đáy ống nghiệm.

11.Rửa tủa bẳng EtOH 70%, đổ bỏ dịch và phơi phô trong 15 -20 phút. 12.Thêm 100 µl nƣớc cất khử trùng vào mỗi ống, vortex cho tan hết tủa

sau đó cất mẫu vào tủ lạnh ngăn mát.

2.2.2.2.Phương pháp PCR bằng mồi dCAPs

Phƣơng pháp nghiên cứu sử dụng PCR kiểm tra sự có mặt của gene fea*

trong các con lai. Sử dụng chỉ thị phân tử dCAPs đặc hiệu cho đột biến điểm của allele fea*. Bommert et al., 2013, tác giả đã có sẵn trình tự các cặp mồi kiểm tra gene fea* (allele fea2-1328). Cặp mồi này khi nhân tạo ra sản phẩm PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme SmlI, còn sản phẩm PCR nhân lên từ allele hoang dại không đột biến sẽ không bị cắt. Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ thiết kế thêm các cặp mồi OVS1 – OVS2 dựa trên trình tự của gene FEA2. Cặp mồi OVS1 – OVS2 khi nhân tạo ra sản phẩm PCR, sản phẩm PCR nhân lên từ allele đột biến sẽ bị cắt bằng enzyme PstI

Trình tự cặp mồi sử dụng cho kiểm tra đột biến fea* bởi Bommert et al.,

2013

Tên mồi Trình tự

Fea*F 5’-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3’

- Trình tự cặp mồi dCAPs dùng trong PCR:

Tên mồi Trình tự

OVS1 –F 5’-GCAACCTCCCCATGCCCCCAAGC CCCGCA-3’

OVS1 –R 5’-GTTTGTGTCAGCTTCTGTGGAC-3’

- Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi dCAPS

Phản ứng PCR đƣợc chạy với chu kỳ nhiệt với cặp mồi OSV1 và OSV2 đƣợc trình bày cụ thể 2 bƣớc nhƣ sau: Tên thành phần Thể tích (µl) DNA 2 Nƣớc cất 4.45 Buffer fx 10 0.8 dNTP 0.25 Taq 0.7 OSV 1 0.4 OSV 2 0.4 DMSO 1 Tổng cộng: 10

• Bƣớc 1: Cặp mồi OSV1/OSV2 biến tính ở 940 C trong 3 phút (tách mạch DNA khuôn), chạy 5 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 52 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài).

• Bƣớc 2: Chạy 39 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 20 giây, 59 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 30 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong 5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng).

Hình 2.2. Chu kỳ nhiệt PCR với cặp mồi OSV1 và OSV2

2.2.2.3. Phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn PstI

Sử dụng cặp mồi OSV1 và OSV2 trong PCR khuếch đại đƣợc đoạn DNA dài 212bp, sau đó sản phẩm PCR đƣợc cắt bởi enzyme cắt giới hạn PstI tại điểm không đột biến trên đoạn DNA nhờ đó phân biệt đƣợc các kiểu gen khác nhau của các cá thể đồng hợp trội (không đột biến), dị hợp và đồng hợp lặn (gen đột biết). Phản ứng cắt DNA nhờ eyme cắt giới hạn PstI trong điều kiện 370C trong 2 giờ, dƣới đây là bảng thành phần dung dịch phản ứng cắt PCR bằng PstI.

- Thành phần dung dịch phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Pst I Tên thành phần Thể tích (µl) Sản phẩm PCR (DNA) 10 Buffer Cs 2 Pst I 0.5 Nƣớc cất 7.5 Tổng cộng 20

Enzyme giới hạn PstI cắt sản phẩm PCR, sau khi điện di trên gel agarose 3% và nhuộm sẽ quan sát thấy 2 băng với kích thƣớc 212 bp và 192bp, còn băng kích thƣớc 20bp kích thƣớc quá nhỏ nên không thể hiện trong bản gel. Nhƣ vậy, cá thể có kiểu gen đồng hợp trội sẽ thể hiện 1 băng trên bản gel với kích thƣớc 192 bp, cá thể mang kiểu gen đồng hợp lặn (không bị Pst I cắt) sẽ thể hiện trên bản gel 1 băng với kích thƣớc 212 bp và cá thể mang kiểu gen dị hợp sẽ có 2 băng trên bản gel kích thƣớc 212bp và 192 bp

Thành phần dung dịch phản ứng PCR với mồi SSR

Phản ứng PCR đƣợc chạy với chu kỳ nhiệt:

• Bƣớc 1: Cặp mồi SSR biến tính ở 940 C trong 3 phút (tách mạch DNA khuôn.

• Bƣớc 2: Chạy 39 chu kỳ lặp lại với 940 C trong 30 giây, 55 0C trong 30 giây (gắn mồi), 72 0C trong 40 giây (kéo dài), cuối cùng giữ ở 72 0C trong 5 phút (hoàn thành chuỗi phản ứng).

2.2.2.5. Phương pháp điện di trên gel poly-acrylamide

Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 6,0% và đƣợc phát hiện dƣới tia cực tím bằng phƣơng pháp nhuộm ethidium bromide.

Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thƣớc 30cm x 12cm): Tên thành phần Thể tích (µl) DNA 2 Nƣớc cất 3.65 Buffer fx 10 0.8 dNTP (10mM) 0.25 Primer (10mM) 1.6 Taq 0.7 DMSO 1 Tổng cộng: 10

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính. Sau 30 phút gel đƣợc polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker có trọng lƣợng chuẩn ở điều kiện 150V. Thời gian điện di khoảng 50 - 60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nƣớc sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.

2.2.2.6. Phương pháp điện di trên gel Agarose

Khi tiến hành điện di gel agarose chúng tôi dùng thuốc nhuộm ethydium bromide để hiện hình các băng DNA trên gel. Chất này sẽ gắn vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại.

Sản phẩm sau khi sử dụng enzyme cắt giới hạn sẽ đƣợc điện di trên gel agarose 3% để phân tách các đoạn DNA cùng với marker 100bp.

Cách tiến hành:

1. Cân 1.2g agarose cho vào bình tam giác, bổ sung 40 ml dung dịch TAE 1X lắc nhẹ cho agarose hòa lẫn trong dung dịch.

2. Đun bình trong lò vi sóng 1-2 phút, dung dịch sôi và trở thành trong suốt.

3. Đổ gel vào khay (đã đặt sẵn lƣợc), để gel đông lại sau đó chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di, đổ đệm TAE 1X ngập bản gel khoảng 0.5 cm.

Nƣớc cất khử ion 29,2 ml TBE 10X 2 ml Dd acrylamide 40% 6 ml Dung dịch APS 10% 400 µl Dung dịch TEMED 25 µl Tổng thể tích gel 40ml

4. Tra mẫu: Mẫu đƣợc đánh dấu bằng cách bổ sung thêm loading dye, tra 10 µl mẫu vào từng giếng

6. Chạy điện di: sau khi tra mẫu điện di xong, kết nối máy điện di với bộ nguồn, đặt 120V, chạy khoảng 30 phút.

7. Chụp ảnh gel: gel đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại, băng DNA sẽ phát sáng nhờ liên kết với ethydium bromide. Chụp ảnh gel.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ

3.1.1. Kết quả xác định chỉ thị đa hình giữa các dòng ML10, BL10 và dòng W22 trên 10 NST và dòng W22 trên 10 NST

3.1.1.1. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa dòng ML10 và dòng W22 dòng ML10 và dòng W22

Để kiểm tra xác định chỉ thị phân tử đa hình nằm ngoài vùng locus gen

fea* trên toàn bộ 10 NST phục vụ công việc xác định nền di truyền các cá thể

trong quần thể chọn tạo. Thí nghiệm đã sử dụng 300 chỉ thị SSR kiểm tra xác định đa hình giữa dòng ML10 và W22 (bảng 3.1, hình 3.1 đến hình 3.10), kết quả cho thấy:

300 mồi SSR nằm rải rác trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc tham khảo và sử dụng dựa trên cơ sở dữ liệu. Các chỉ thị đƣợc đánh giá về mức độ đa hình giữa dòng ML10, BL10 với W22 để sàng lọc các chỉ thị cho đa hình, đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền.

Từ 300 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng để xác định mức tính đa hình giữa ML10 và W22, kết quả đã xác định đƣợc tổng số 31 chỉ thị cho đa hình rải rác trên 10 nhiễm sắc thể (NST). Trên Nhiễm sắc thể số 1 (NST1), đã xác định đƣợc 4 chỉ thị đa hình không liên kết locus gen fea* là umc1754, umc1160,

umc1166, umc1630. Bốn chỉ thị cho kết quả đa hình: bnlg381, umc1506, umc1947, umc1633 trên NST2; 4 chỉ thị đa hình: umc2101, umc1030, phi053, bnlg1035 trên NST3. Trên NST4, NST5, đều xác định số lƣợng chỉ thị đa hình bằng nhau.Tại NST4 có 3 chỉ thị phi072, umc1847, phi021. Tƣơng tự trên NST5, các chỉ thị umc1097, umc1591, umc1349. Trên NST6 có 2 chỉ thị (umc1143, phi070) cho đa hình trên tổng số chỉ thị đƣợc khảo sát. Tại NST7 xác định các chỉ thị đa hình là: umc2177, umc1407. Các chỉ thị đa hình trên NST8: umc1974, umc1904, phi233376. Trên NST9, các chỉ thị đa hình là: umc1137, phi027, phi061, bnlg1129. Trên NST10 xác định đƣợc 2 chỉ thị (umc1380, umc1239) đa hình trên tổng số chỉ thị đã khảo sát giữa hai

dòng ML10 và W22. Các chỉ thị cho đa hình giữa ML10 và W22 trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền của các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea*.

Bảng 3.1. Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng ML10 và W22

STT Tên mồi SSR Mồi xuôi Mồi ngƣợc Vị trí NST

1 umc1160 CGTTTGATATGATGTGGAGATTCG AAGCTTGTGAATGTTCTGGATGTC 1.01 2 umc1166 CGATCAGATCATACACAACCTTGC GAGGATCGATTCTTGGCGAGT 1.02 3 umc1754 ATAGGGATCGACCCGTTCGT AATATCTCCGATCCACCAACAAAA 1.06 4 umc1630 CAGACCTTCGAGGGCAAGAACT AGTTTTGGCTTCTTCTCCCAAGTC 1.11 5 bnlg381 TCCCTCTTGAGTGTTTATCACAAA GTTTCCATGGGCAGGTGTAT 2.02 6 umc1506 AAAAGAAACATGTTCAGTCGAGCG ATAAAGGTTGGCAAAACGTAGCCT 2.07 7 umc1947 GGATCTCACCCCCTGCTGTC ATCACGCGCTCACTCTCCTCT 2.08 8 umc1633 GTCCTTCCTCTCCTTCGTGCATA CAGAGGCTGTTGTTCCCCAC 2.08 9 umc1030 TCCAGAGAATGAGATGACAAGACG CAGAATAACAGGAGATGAGACGCA 3.04 10 phi053 CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC AACCCAACGTACTCCGGCAG 3.05 11 umc2101 CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAAGT CTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGAT 3.00 12 bnlg1035 TGCTTGCACTGTCAGGAATC CAGCTCTGACACACCACACA 3.05 13 phi072 ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT 4.00 14 phi021 TTCCATTCTCGTGTTCTTGGAGTGGTCCA CTTGATCACCTTTCCTGCTGTCGCCA 4.03 15 umc1847 GCCCAAGGTAGATTTTTACTCTCCA AAGTCGTAGAGCTCGTCGTGATG 4.07 16 umc1097 CTCGTCAACGTCAACCCAAGTAAG CTGTTAGATGTGCGACAACAGAGC 5.00 17 umc1591 GAGGTCTCTCTCGGTCGACATC CAACCAACTGGCAACTACTCGAC 5.04 18 umc1349 ACGACCAGTGCTTCGCTCAC AGTTTCCATCGTATGATGTCGAGG 5.04 19 umc1143 GACACTAGCAATGTTCAAAACCCC CGTGGTGGGATGCTATCCTTT 6.00 20 phi070 GCTGAGCGATCAGTTCATCCAG CCATGGCAGGGTCTCTCAAG 6.07 21 umc2177 ACCATGCATGTCTCACGTCACT GGGTACGTGCTGTGGAGGAC 7.00 22 umc1407 AGGCTTACCTCCTGAGAAGCAGTT AGGCTTAGCATCGGTGGAGAG 7.05 23 umc1974 ACAAGGAGACCCTCCTCAGCTAGT GTAAGCTGTGGCCATACTACCACC 8.02 24 umc1904 CAGCCACTCGTTTATGGAGGTTTA TGTTACTAGTCGATCTGATGCCCA 8.03 25 phi233376 CCGGCAGTCGATTACTCC CGAGACCAAGAGAACCCTCA 8.09 26 umc1137 ATCAGTCACTCTTCTGCCTCCACT GGCTGGATAATGTTGTAGCTGGTC 9.00 27 phi027 CGGGATCAGTCGTTACAAACATAG GCGTACGTACGACGAAGACAC 9.03 28 phi061 GACGTAAGCCTAGCTCTGCCAT AAACAAGAACGGCGGTGCTGATTC 9.03 29 bnlg1129 GAGAGTATGCTACTCGCCGC GACGAGTTTGGAGTGCCATT 9.08 30 umc1380 CTGCTGATGTCTGGAAGAACCCT AGCATCATGCCAGCAGGTTTT 10.00 31 umc1239 ATCAACACACCTTTCGATTTCTGG CGGTGATTAGTCGATGAAGAGTGA 10.03

3.1.1.2. Kết quả xác định chỉ thị phân tử đa hình ngoài vùng gen fea* giữa dòng BL10 và dòng W22 dòng BL10 và dòng W22

Trong 300 chỉ thị SSR đƣợc sử dụng xác định đƣợc 26 chỉ thị cho kết quả đa hình giữa BL10 và W22, chiếm 8,7 % số cặp mồi tham gia phản ứng (bảng 3.2). Trên nhiễm sắc thể 1, 2 và 6 có nhiều chỉ thị đa hình với 4 chỉ thị trên NST1 (bnlg439, umc1160, umc1976, umc1819), trên NST2 gồm phi083, umc1875, umc1635, umc1506 và NST6 gồm umc0241, phi299852, umc1143, phi070. Nhóm nhiễm sắc thể có số lƣợng chỉ thị cho kết quả đa hình tƣơng đƣơng nhau là NST3, NST5 và NST9; NST4 và NST10. Cụ thể, trên NST3 xác định đƣợc các chỉ thị đa hình gồm: umc2101, umc1030, trên NST5 gồm umc1097, umc1349 và trên NST9 chỉ thị đa hình là umc2340, phi022. Tƣơng tự, chỉ thị đa hình trên NST4 là 3 chỉ thị: phi072, bnlg1217, bnlg2162 và trên NST10 với 3 chỉ thị gồm: phi041, umc1380, umc1239. Nhóm nhiễm sắc thể có ít chỉ thị đa hình là NST7 (umc2177) và NST8 (umc1904). Các chỉ thị cho đa hình giữa BL10 và W22 trên 10 nhiễm sắc thể đƣợc sử dụng để đánh giá nền di truyền của các dòng bố mẹ cải tiến mang gen fea*

Các chỉ thị phân tử đa hình trên 10 NST sẽ đƣợc sử dụng để xác định nền di truyền giữa các cá thể trong quần thể chọn tạo giống.

Bảng 3.2. Các thông tin chi tiết chỉ thị cho đa hình trên 10 nhiễm sắc thể giữa dòng BL10 và W22

STT Tên mồi SSR Mồi xuôi Mồi ngƣợc

Vị trí NST

1 bnlg439 TTGACATCGCCATCTTGGTGACCA TCTTAATGCGATCGTACGAAGTTGTGGAA 1.03 2 umc1160 CGTTTGATATGATGTGGAGATTCG AAGCTTGTGAATGTTCTGGATGTC 1.01 3 umc1976 TGCCGAGGCTTCTAGTAGACCAA CGCTATATCTATCCCGCAGCAAC 1.02 4 umc1819 GCTGCTCTAAAATCATGCTGATAAAA TATTCAGCAATGTATTCCCCCTGT 1.12 5 phi083 CAAACATCAGCCAGAGACAAGGAC ATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT 2.04 6 umc1635 GCTGAGCAGATCTTTCCTTGTTTC AAGGAGCAGAACTCGGAGACG 2.05 7 umc1875 AAGCGACAGTTGGTTTCAGTTTTC AGTTGCATGACCTTGTCAACCTTT 2.06 8 umc1506 AAAAGAAACATGTTCAGTCGAGCG ATAAAGGTTGGCAAAACGTAGCCT 2.07 9 umc1030 TCCAGAGAATGAGATGACAAGACG CAGAATAACAGGAGATGAGACGCA 3.04 10 umc2101 CCCGGCTAGAGCTATAAAGCAAGT CTAGCTAGTTTGGTGCGTGGTGAT 3.00 11 bnlg1217 AGCTGATCTGCACGTTGTTG GCAGATCCACGCCATTTAAA 4.05 12 phi072 ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT 4.00 13 bnlg2162 GTCTGCTGCTAGTGGTGGTG CACCGGCATTCGATATCTTT 4.08 14 umc1097 CTCGTCAACGTCAACCCAAGTAAG CTGTTAGATGTGCGACAACAGAGC 5.00 15 umc1349 ACGACCAGTGCTTCGCTCAC AGTTTCCATCGTATGATGTCGAGG 5.04 16 umc1143 GACACTAGCAATGTTCAAAACCCC CGTGGTGGGATGCTATCCTTT 6.00 17 umc0241 TATATCCGTGCATTTACGTTT CATCGCTTGTCTGTCGA 6.05 18 phi299852 GATGTGGGTGCTACGAGCC AGATCTCGGAGCTCGGCTA 6.07 19 phi070 GCTGAGCGATCAGTTCATCCAG CCATGGCAGGGTCTCTCAAG 6.07 20 umc2177 ACCATGCATGTCTCACGTCACT GGGTACGTGCTGTGGAGGAC 7.03 21 umc1904 CAGCCACTCGTTTATGGAGGTTTA TGTTACTAGTCGATCTGATGCCCA 8.03 22 umc2340 GCTAGCTCACCTACTCTGTGGCTG ACAGGGAGTAGAGGACGAGCG 9.03 23 phi022 TGCGCACCAGCGACTGACC GCGGGCGACGCTTCCAAAC 9.03 24 umc1380 CTGCTGATGTCTGGAAGAACCCT AGCATCATGCCAGCAGGTTTT 10.00 25 phi041 TTGGCTCCCAGCGCCGCAAA GATCCAGAGCGATTTGACGGCA 10.00 26 umc1239 ATCAACACACCTTTCGATTTCTGG CGGTGATTAGTCGATGAAGAGTGA 10.03

Nhƣ vậy trong tổng số 300 chỉ thị phân tử trên 10 NST sử dụng trong khỏa sát đa hình xác định đƣợc 31 chỉ thị phân tử cho kết quả đa hình giữa ML10 và W22, 26 chỉ thị phân tử cho kết quả đa hình giữa BL10 và W22. Những chỉ thị phân tử đa hình này sẽ đƣợc sử dụng xác định nền di truyền các cá thể trong quần thể chọn tạo giống bằng phƣơng pháp chỉ thị phân tử và lai trở lại

Hình 3.1. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST1 giữa các dòng ML10, BL10, và W22

(Tên mồi đƣợc hiển thị phía trên của bản giếng. Thứ tự các mẫu từ trái qua phải: ML10-BL10-W22, sử dụng Ladder 20bp )

Hình 3.2. Kết quả khảo sát đa hình các chỉ thị phân tử trên NST2 giữa các dòng ML10, BL10, và W22