Tiến hành chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinusvới các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ), với hệ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) thích hợp đã được xác định và nhiệt độ chiết 4 oC. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, HTTS và HTR của từng DC. So sánh, chọn ra thời gian chiết thích hợp.
Rong BG
Rửa sạch
Xay nhuyễn
Chiết
2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ
Lọc Bã Ly tâm Xác định: Dịch chiết HTTS và HTR Nhiệt độ chiết phù hợp
2.3.6 Khảo sát nồng độ tác nhân tủa thích hợp để thu tủa protein- lectin
Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein lectin ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính NKHC sau khi kết tủa.
Tiến hành khảo sát khả năng tủa lectin từ DCT bằng tác nhân tủa là ethanol ở các nồng độ khác nhau.
Hệ tác nhân tủa khảo sát gồm ethanol được làm lạnh ở nhiệt độ 4oC, với nồng độ % ethanol lần lượt là 70 %, 80 % và 90 %.
Thu nhận kết tủa bằng ly tâm hỗn hợp ở 4 oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 30 phút, hòa tan với dung dịch đệm không muối PB 0,02M; pH= 7,5và đưa về cùng thể tích. Sau đó, tiến hành xác định HTTS, HTR và hiệu suất thu hồi của CPKT, từ đó chọn ra nồng độ tủa thích hợp.
2.3.7 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAF- Sepharose
Nhựa DEAE – Sepharose là nhựa trao đổi anion yếu. Hỗn hợp mẫu qua cột sắc ký chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện tích âm khác nhau, do đó, khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau. Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trước, còn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn.
Lectin từ dịch chiết sau khi kết tủa được thẩm tách từ 2 – 3 lần trong đệm PB 0,05M để loại hoàn toàn lượng muối PBS còn trong dịch tủa. Sau đó, tiến hành tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion với các thông số được thiết lập như sau:
- Gel: DEAE – Sepharose
-Kích thước cột: 1,6 x 20 cm
-Đệm:cacbonat 0,02M; pH = 9,0 (đã loại khí);
cacbonat 0,02M, NaCl 0,5M, pH = 9,0 (đã loại khí). - Thể tích mẫu: 5ml
- Tốc độ dòng: 5ml/phút - Số lượng phân đoạn: 40 phân đoạn.
- Tổng thể tích rửa giải: 345 ml.
Xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giá trị A280 nm, hoạt tính ngưng kết hồng cầu và thứ tự các phân đoạn.
2.3.8 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200
* Nguyên tắc:Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có khối lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những protein có khối lượng phân tử lớn di chuyển nhanh và ra khỏi cột trước, những protein có khối lượng phân tử nhỏ di chuyển chậm qua lỗ gel và ra khỏi cột sau.
* thuật:Kỹ Các thông sốtinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thiết lập như sau: Gel: SephacrylS - 200
Kích thước cột:đường kính 1cm, chiều cao 30cm Đệm: PB 0,05M NaCl 0,15M; pH = 7 (đã loại khí) Thể tích mẫu:1ml
Tốc độ dòng:0,80 ml/phút
Thể tích mỗi phân đoạn:2,5ml/phân đoạn Số lượng phân đoạn:52 phân đoạn; 2,5 ml/ống.
Rửa cột: dd NaOH 0,2M (v = 0,5 ml/ph), rửa giải 0,5V cột = 65 ml Rửa lại 2V cột với đệm 250 ml (v = 0,8 ml/phút).
Xác định hoạt tính NKHC của tất cả các phân đoạn, thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa.
2.3.9 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE [117]
*Nguyên tắc:
SDS - PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol. Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Để xác định khối lượng phân tử của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có khối lượng phân tử khác nhau đã biết.
*Thực hiện:
Đổ gel:
a/ Gel phân tách 12,5% (Separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch: Acrylamide/Bis (15,5/1) : 3,8 ml Tris – HCl 3M; pH 8,8; 0,8 % SDS : 5 ml Glycerine : 2 g Nước cất : 4,2 ml APS 10% : 50 µl TEMED : 5 µl
Sau khi cho TEMED vào, khuấy nhẹ, tiến hành đổ gel (tránh tạo bọt khí). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nước cất lên trên lớp mặt gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông (khoảng 2 giờ).
b/ Gel cô nồng độ (Stacking gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào cốc 25 ml sạch khác: Acrylamide/Bis (15,5/1) : 1 ml
Tris – HCl 3M; pH 6,8; 0,8 % SDS : 3,1 ml
Nước cất : 8,4 ml
APS 10% : 100 µl
TEMED : 10 µl
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn, đổ hết nước bên trên. Tiến hành đỗ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt
khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di.
c/ Chuẩn bị mẫu:
- Mẫu protein thô :200 µg.
- Mẫu protein kết tủa : 100 µg. - Mẫu protein sau sắc ký trao đổi ion : 50 µg. - Mẫu protein sau sắc ký lọc gel :30 µg.
Tất cả các mẫu được thẩm tách bằng nước cất ở 4 oC để loại bỏ ảnh hưởng của muối, sau đó cho vào ống eppendorf và sấy ở 40 oC đến khô.
Thêm vào mỗi ống 15 µl dung dịch đệm mẫu, khuấy đều đến tan hoàn toàn.
Đun các ống mẫu ở 100 oC trong 5 phút, có và không có chất khửβ- mercaptoethanol.
Sau đó, làm lạnh các ống.
d/ Tiến hành chạy điện di
Cho 20µl dung dịch mẫu cần kiểm tra vào các giếng. Tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Quá trình điện di kết thúc dựa vào sự dịch chuyển của vạch màu xanh (bromophenol) khi cách đáy gel khoảng 1 cm.
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R-250, trong 30 phút. Sau đó cho tiến hành tẩy màu bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm (hỗn hợp methanol: acid acetic: nước). Protein sẽ được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
Xác định trọng lượng phân tử của protein
Đo khoảng cách di chuyển của các băng protein từ gel phân tách tới các băng protein và khoảng cách từ gel phân tách tới vạch màu bromophenol (vạch màu cuối cùng).
Tính giá trị Rf
Rf = Khoảng cách di chuyển của protein lectin
Trọng lượng phân tử của các vạch protein có thể xác định thông qua giá trị Rf trên, nhờ phương pháp nội suy theo đồ thị.
Dựa vào thang chuẩn trên gel điện di, tiến hành xác định giá trị Rf của từng vạch protein. Kết quả được trình bày trong Bảng 2 (phụ lục B). Từ đó, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lgM (lg trọng lượng phân tử) của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel (hình 2, phụ lục B)
Để kiểm tra lectin là protein hay glycoprotein, sau khi điện di gel được nhuộm với thuốc thử periodic acid-Schiff (PAS) [118].
2.3.10 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lý, hóa của lectin từ rong biển B. Gelatinus
2.3.10.1 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu [13]
Để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của lectin từ rong đỏ B. gelatinus, ta lấy mỗi 0,5 ml dung dịch chứa lectin thu được sau sắc ký lọc gel cho vào mỗi ống nghiệm, tiến hành đun nóng ở các nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oC trong 30 phút. Sau đó làm lạnh nhanh bằng nước đá và kiểm tra lại hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các mẫu bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin.
Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.3.10.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của pH đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu[13]
Lấy 0,5 ml mỗi dung dịch chứa lectin thu được sau sắc ký lọc gel thẩm tách qua đêm trong các dung dịch đệm có pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ở 4 oC. Sau đó, tiến hành thẩm tách ngược lại với dung dịch NaCl 0,15 M trong 4 giờ để loại bỏ ảnh hưởng của pH, lấy phần dịch này đem ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút. Thu lấy phần dịch trong và tiến hành đo hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các mẫu bằng hồng cầu máu thỏ 2 % đã xử lý trypsin.
Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. Các dung dịch đệm được sử dụng:
+ Đệm photphat pH: 6 và 7 Na2HPO4.12H2O/NaH2PO4.2H2O
+ Đệm Tris HCl pH: 8 Tris/HCl
+ Đệm cacbonat pH: 9 và 10 Na2CO3/NaHCO3
2.3.10.3 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu[13]
Lấy 1,0 ml dịch lectin sau sắc ký lọc gel cho tương tác với muối của các ion kim loại hóa trị hai như: Ca2+, Mg2+ ở nồng độ 50 mM. Sau 2 giờ, các mẫu thí nghiệm được xác định hoạt tính ngưng kết hồng cầu và so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với cation hóa trị II và EDTA).
Các thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần.
2.3.10.4 Phương pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin
*Điều chế porcine stomach mucin được xử lý enzyme trypsin
Hòa tan 10 mg porcine stomach mucin trong 5 ml dung dịch đệm photphate 20 mM có chứa 150 mM NaCl (pH 7.2). Thêm 5 mg trypsin vào mẫu và ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Sau đó hỗn hợp được đun nóng ở 100 °C trong 30 phút để hủy hoạt tính của enzyme và được dùng cũng như chất ức chế (nồng độ cuối cùng 2 mg/ml) [119].
*Phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin
Đặc tính liên kết carbohydrate được tiến hành theo phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Hori [49], [55].
Tiến hành khảo sát khả năng liên kết carbohydrate của lectin với một số loại đường đơn (monosaccarit) và glycoprotein được liệt kê trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2 Các loại đường monosaccarit và glycoprotein sửdụng đểkhảo sát đặctính
liên kết carbohydrate của lectin.
Monosaccarit (100 mM) Glycoprotein (2000µg/ml)
Glucose Transferrin
N-acetyl D-glucosamin Asialo- Transferrin Nitrophenyl glucopyranoside Fetuin
N-D-galactosamine Yeast mannan
N-acetyl D- galactosamine Porcine thyroglobulin Nitrophenyl galactopyranoside Porcine stomach mucin
Mannose Asialo- Porcine stomach mucin
N-D-manosamine Porcine stomach mucin (PSM) xử lý N-acetyl-D-manosamine Trypsin
Nitrophenyl manopyranoside D-glucosamine
Xylose
N-acetyl neulaminic acid
Tiến hành:
Sử dụng đĩa 96 giếng đáy chữ V. Cho 25µl NaCl 0,85% vào các giếng. Cho 25µl dung dịch đường hoặc glycoprotein vào giếng số 1 và số 2, rồi pha loãng 2 lần theo từng hàng bắt đầu từ giếng số 2.
Cho 25µl dung dịch lectin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Sau 1 giờ, cho 25µl huyền phù hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào mỗi giếng.
Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
Đọc kết quả:
Nếu hoạt tính NKHC của lectin không thay đổi: Lectin không có khả năng liên kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra.
Nếu hoạt tính NKHC của lectin giảm: Lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra. Nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (2.000 µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn (nghĩa là lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein kiểm tra), được tính theo công thức:
Trong đó:
Cmin: Nồng độ phản ứng nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn.
C: Nồng độ của đường và glycoprotein (Nồng độ đường: 100mM; Nồng độ glycoprotein: 2000µg/ml).
HI: Giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt tính NKHC vẫn còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH NGƯNG KẾT HỒNG CẦU CỦA DỊCH CHIẾT TỪ RONG ĐỎ B.GELATINUS
Dịch chiết thô từ rong đỏ B. gelatinus đã ngưng kết mạnh với các hồng cầu thỏ, cừu và gà đã được xử lý với enzyme trypsin, nhưng không cho thấy sự ngưng kết với các dạng hồng cầu máu người A, B và O, ngay cả khi hồng cầu được xử lý enzyme (Bảng 3.1).
Bảng 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong đỏ B.
gelatinus với các dạng hồng cầu khác nhau
Sự chuẩn độ ngưng kết hồng cầu với các dạng hồng cầu
Thỏ Cừu Gà Nhóm máu A Nhóm máu B Nhóm máu O
NT P N TP NTP N TP N T P N T P
- 128 128 - 128 128 -3232 -d -- - -- - - -
N Hồng cầu tự nhiên; T Hồng cầu được xử lý enzyme trypsin; P Hồng cầu được xử lý enzyme papain; dKhông có sự ngưng kết hồng cầu.
Kết quả nghiên cứu này tương thích với các kết quả nghiên cứu đã được công bố về sự ngưng kết với hồng cầu động vật ưu tiên hơn hồng cầu người của các dịch chiết lectin từ rong biển [13], [15], [35], [37], [40], [41], [46].
3.2 CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG B. GELATINUS
3.2.1 Tỷ lệ dung môi chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v)lần lượt là 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ở nhiệt độ 4 oC, thời gian chiết 6 giờ. Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết. Xác định hoạt tính tổng số (HTTS) và hoạt tính riêng (HTR) của lectin. Kết quả được trình bày ở bảng 3 (phụ lục C) và hình 3.1.
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin. Hoạt tính tổng số ( ) và hoạt tính riêng ( ).
Từ thí nghiệm trên, có thể nhận thấy thể tích dung môi dùng để tách chiết có ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết và hoạt tính NKHC của dịch chiết từ rong B. gelatinus.
Nhìn chung, khi tăng thể tích dung dịch đệm thì HTTS tăng (từ 10 lên 16,8 HU) và HTR cũng tăng dần (từ 4,278 lên 7,619 HU/mg). Vì lúc này quá trình khuếch tán của protein lectin vào trong dung dịch đệm cũng tăng lên, làm tăng khả năng NKHC, nên HTTS và HTR đều tăng. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng lượng dung dịch đệm lên quá cao (tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) = 1:6) thì hoạt tính NKHC lại giảm, vì lúc này một lượng protein không có hoạt tính NKHCcũng sẽ khuếch tán ra ngoài và làm ảnh hưởng đến hoạt tính NKHC của dịch chiết nên HTTS và HTR đều giảm (HTTS:10,8 HU; HTR:6,780 HU/mg).
Kết quả từ hình 3.1 cho ta thấy, ở tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) là 1:5 thì HTTS và HTR đều đạt cực đại (16,8 HU và 7,619 HU/mg). Vì vậy chúng tôi chọn tỷ lệ này cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết
Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinusvới dung môi ethanol, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 1:5, nhiệt độ chiết 4 oC và thời gian chiết 6 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định HTTS và HTR của từng DC. Kết quả được trình bày ở bảng 4 (phụ lục C) và hình 3.2.
Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng