Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ B. gelatinus không bị ức chế bởi các đường đơn như D-glucose, D-mannose, D-galactose, D- xylose, N-acetyl-glucosamine, N-acetyl-D-mannosamine, N-acetyl- galactosamine, N-acetyl-neraminic axit glycoproteins như transferrin, asialo- transferrin và fetuin, nhưng bị ức chế mạnh bởi các glycoprotein mang dạng N-glycan high-mannose như yeast mannan và porcine thyroglobulin, chỉ ra rằng lectin này đặc hiệu cho N-glycan dạng high-mannose.
Bảng 3.4 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chếhoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong B. gelatinus (BGL)
Đường và glycoprotein Lectins
BGL KAA- KSA- EDA- ESA- HRLe
2a 2b 2c 2d Đường (mM) D-galactose -f - - - - - N-acetyl-D-galactosamine - - - - - - D-glucose - - - - - - N-acetyl-D-glucosamine - - - - - - D-mannose - - - - - - N-acetyl-D-mannosamine - - - - - -
N-acetyl neuraminic acid - - - - - -
D-xylose - - - - - - Glycoproteins (µg/mL) Transferrin - - - - - - Asialo-transferrin - - - - - >1000 Fetuin - 31.2 31.2 62.5 62.5 >1000 Asialo-fetuin 125.0 31.2 31.2 125.0 31.2 >1000 Yeast mannan 7.8 3.9 1.9 3.9 3.9 15.6 Porcine thyroglobulin 7.8 1.9 0.9 1.9 3.9 62.5
Porcine stomach mucin 125.0 - - - ND ND
Asialo-porcine stomach mucin 250.0 - - - ND ND Trypsin treated porcine stomach 250.0 - - - ND ND mucin
aLectin KAA-2 từrong K. alvarezzi[14] bLectin KSA-2 từ rongK. striatum[6] cLectin EDA-2 từrongE. denticulatum[7] dLectin ESA-2 từ rongE. serra[61] eLectin HRL từ rongH. renschii [121]
fKhông có sự ức chế đường (100mM) hay glycoprotein (2000µg/ml) ND không xác định.
Transferrin chỉ mang N-glycan dạng phức và fetuin mang cả hai N- glycan dạng phức và O-glycan đã không ức chế hoạt tính ngưng kết hồng cầu
của lectin này. Tuy nhiên, sự loại bỏ các gốc axit sialic của fetuin đã tăng hoạt tính ức chế so với fetuin ban đầu.
Porcine stomach mucin mang dạng O-glycan và dẫn xuất asialo của nó cho thấy hoạt tính ức chế. Sự loại bỏ gốc axit sialic của porcine stomach mucin không làm thay đổi hoạt tính ức chế, chỉ ra rằng các gốc axit sialic cuối cùng của chuỗi cacbohydrate trong porcine stomach mucin không ảnh hưởng đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin.
Yeast mannan mang N-glycan dạng high-mannose với liên kết (α1-6) trong cấu trúc lõi của nó và liên kết (α1-3) trong các chuỗi nhánh đã cho thấy hoạt tính ức chế mạnh, chỉ ra rằng lectin BGL có thể nhận biết các gốc mannose được liên kết ở vị trí (α1-6) và (α1-3) trong cấu trúc của yeast mannan (Hình 3.10).
Porcine thyroglobulin cho thấy hoạt tính ức chế sự ngưng kết hồng cầu mạnh. Glycoprotein này chứa các chuỗi oligosaccharides dạng high mannose (nhómdạng A) và dạng phức (nhóm dạng B).Trong nhóm dạng A của porcine thyroglobulin, cấu trúc chung của N-glycan dạng high-mannose là Man5GlcNAc2Asn với các gốc Man(α1-6) và Man(α1-3) được phân nhánh từ nhánh man(α1-6) của lõi pentasaccharide [122]. Trong nhóm dạng B, N- glycan chứa ít nhất 9 dạng cấu trúc khác nhau bao gồm các cấu trúc monosialyl, disialyl được gắn với gốc fucose ở vị trí (α1–6) và được kết thúc với các gốc axit sialic liên kết ở vị trí (α2–3) hoặc (α2–6) [123]. Các kết quả chỉ ra rằng lectin từ rong B. gelatinus có thể tương tác với các gốc Man(α1–3) hoặcMan(α1–6) ở vị trí cuối cùng trong cấu trúc Man(α1–6)[Man(α1– 3)]Man(α1–6)[Man(α1–3)] Man(β1–4)GlcNAc(β1–4)GlcNAc-của yeast mannan và porcine thyroglobulin (nhóm dạng A) (Bảng 3.4).
Hình 3.10 Lectin từ rong đỏB. gelatinusliên kết với các gốc đường mannose được thể hiện trong hình chữ nhật. Man: Mannose; Gal: Galactose; Fuc: Fucose; GlcNAc: N-acetyl-D-glucosamine; GalNAc: N-acetyl-D-galactosamine, NeuAc: N- acetylneuraminic acid; Asn: Asparagine; Ser/Thr: Serine/Threonine.
Hoạt tính ngưng kết hồng cầu bị ức chế bởi yeast mannan và porcine thyroglobulin, mà nó liên quan đến đặc tính liên kết với N-glycan dạng high- mannose cũng đã được thông báo cho nhiều lectin từ rong biển có hoạt tính kháng virus HIV, virus cúm, kháng ung thư và kháng khuẩn, như lectin ESA từ rong E. Serra [2], [3], [10], [11], [12], KAA từ rong K. alvarezii [4], [5], BCA từ rong B. coacta [124], KSA từ rong K. striatum, EDA từ rong E. denticulatum [7], [16], HRL từrong H. renschii (HRL) [121] và SfL từrong
S. filiformis[8], tất cả chúng đều liên kết đặc hiệu với N-glycan dạng high- mannose.Vì vậy lectin liên kết high-mannose từ rong biển hứa hẹn sẽ là một nguồn lectin giá trị để sử dụng trong y học.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được qua các thí nghiệm của đề tài, chúng tôi xin rút ra kết luận như sau:
1. Quá trình chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus đạt hiệu quả tốt nhất với các điều kiện cụ thể như sau:
-Dung môi chiết:ethanol 20%
-Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:5 -Thời gian chiết:4 giờ
-Nhiệt độ chiết:4oC.
2. Quá trình kết tủa protein lectin từ DC rong B. gelatinus đạt hiệu quả cao khi sử dụng ethanol với nồng độ 80 % để làm tác nhân.
3. Lectin từ rong B. gelatinus là protein tồn tại ở dạng monomer với khối lượng phân tử khoảng 19 kDa.
4. Lectin bền nhiệt trong phạm vi rộng từ 20 đến 50 oC.
5. Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin bền trong phạm vi pHtừ3 đến 10 và không phụ thuộc vào cation hóa trị hai và EDTA.
6. Lectin không liên kết với tất cả các loại đường đơn mà chỉ liên kết đặc hiệu với các glycoprotein N-glycan dạng high-mannose. Lectin liên kết với các gốc Man(α1–3) hoặc Man(α1–6) ở vị trí cuối cùng trong cấu trúc Man5GlcNAc2Asn của yeast mannan và thyroglobulin.
7. Đặc tính liên kết với N-glycan dạng high-mannose của lectin từ rong đỏ B. gelatinus tương tự với đặc tính liên kết với N-glycan dạng high-mannose của họ lectin kháng virus HIV, virus cúm, kháng ung thư và kháng khuẩn, gợi ý rằng rong đỏ B. gelatinus hứa hẹn sẽ là nguồn lectin giá trị để sử dụng trong hóa sinh và y học.
KIẾN NGHỊ
1. Xác định khối lượng phân tử chính xác và cấu trúc của lectin.
2. Đánh giá hoạt tính sinh học, bao gồm hoạt tính kháng ung thư và kháng vi khuẩn gây bệnh cho người và sinh vật biển của lectin từ rong B. gelatinus,
hướng đến ứng dụng trong các lĩnh vực y học, nông nghiệp và một số lĩnh vực khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vo T.S., Kim S.K.,(2010), Potential anti-HIV agents from marine resources: an overview,Marine Drugs, 8, pp. 2871-2892.
2. Hori K., Sato Y., Ito K., Fujiwara Y., Iwamoto Y., Makino H., Kawakubo A., (2007), Strict specificity for high manose-type N-glycans and primary structure of a red alga Eucheuma serra lectin,Glycobiology, 17, pp. 479-491.
3. Sato Y., Morimoto K., Kubo T., Sakaguchi T., Nishizono A., Hirayama M., Hori K., (2015), Entry inhibition of influenza viruses with high mannose binding lectin ESA-2 from red alga Eucheumaserra through the recognition of viral hemagglutnin,Marine Drugs, 13, pp. 3454–3465.
4. Sato Y., Morimoto K., Hirayama M., Hori K. (2011a), High mannose- specific lectin (KAA-2) from the red alga Kappaphycus alvarezii potently inhibits influenza virus infection in a strain-independent manner, Biochemical and Biophysical Research Communications, 405, pp.291-296.
5. Hirayama M., Shibata H., Imamura K., Takemasa Sakaguchi T., Hori K., (2016), High-mannose specific lectin and its recombinants from a carrageenophyta Kappaphycus alvarezii represent a potent anti-HIV activity through high-affinity binding to the viral envelope glycoprotein gp120.
Marine Biotechnology, 18, pp. 144–160.
6. Le Dinh Hung, Sato Y., Hori K., (2011), High-mannose N-glycan-specific lectin from the red alga Kappaphycus striatum (Carrageenophyte),
Phytochemistry, 72, pp. 855-861.
7. Le Dinh Hung, Hirayama M., Bui Minh Ly, Hori K., (2015a), Purification, primary structure, and biological activity of high-mannose N- glycan-specific lectin from the cultivated Eucheuma denticulatum, Journal of Applied Phycology, 27, pp. 1657-1669.
8. Chaves R.P., da Silva S.R., Neto L.G.N., Carneiro R.F., da Silva A.L.C., Sampaio A.H., de Sousa B.L., Cabral M.G., Videira P.A., Teixeira E.H., Nagano C.S., (2018), Structural characterization of two isolectins from the marine red alga Solieria filiformis (Kützing) P.W. Gabrielson and their
anticancer effect on MCF-7 breast cancer cells,International Journal of Biological Macromolecules,107, pp. 1320-1329.
9. Sugahara T., Ohama Y., Fukyda A., Hayashi M., Kawakubo A., Kato K., (2001), The cytotoxic effect of Eucheuma serra agglutinin (ESA) on cancer cells and its application to molecular probe for drug delivery systerm using lipid vesicles, Cytotechnology, 36, pp.93-99.
10. Fukuda Y., Sugahara T., Ueno M., FukutaY., Ochi Y., Akiyama K. ,Miyazaki T., Masuda S., Kawakubo A., Kato K., (2006), The anti-tumor effect of Euchema serra agglutinin on colon cancer cells in vitro and in vivo,
Anticancer Drugs, 17, pp. 943–947.
11. Omokawa Y., Miyazaki T., Walde P., Akiyama K., Sugahara T., Masuda S., Inada A., Ohnishi Y., Saeki T., Kato K., (2010), In vitro and in vivo anti- tumor effects of novel Span 80 vesicles containing immobilized Eucheuma serra agglutinin, International Journal of Pharmaceutics,389, pp.157-167.
12. Hayashi K.,Walde P., Miyazaki T., Sakayama K., Nakamura A., Kameda K., Masuda S., Umakoshi H., Kato K., (2012), Active targeting to osteosarcoma cells and apoptotic cell death induction by the novel lectin
Eucheuma serra agglutinin isolated from a marine red alga, Journal of Drug Delivery, 2012:842785.
13. Le Dinh Hung, Hori K., Huynh Quang Nang, (2009a), Screening and preliminary characterization of hemagglutinins in Vietnamese marine algae,Journal of Applied Phycology, 21, pp. 89-97.
14. Le Dinh Hung, Sato Y., Shibata H., Hori K., (2009b), Biochemical comparison of lectins among three different color strains of the red alga
Kappaphycus alvarezii,Fisheries Science, 75, pp. 723-730.
15. Le Dinh Hung, Bui Minh Ly, Vo Thi Dieu Trang, Ngo Thi Duy Ngoc, Le Thi Hoa, Phan Thi Hoai Trinh, (2012), A new screening for hemagglutinins from Vietnamese marine macroalgae, Journal of Applied Phycology, 24, pp. 227- 235.
16. Le Dinh Hung, Hirayama M., Bui Minh Ly, Hori K., (2015b), Biological activity, cDNA cloning and primary structure of lectin KSA-2 from the
cultivated red alga Kappaphycus striatum (Schmitz) Doty ex Silva,
Phytochemistry Letters, 14, pp. 99-105.
17. Liener I.E., Sharon N., Goldstein I.J., (1986), The lectins: properties, functions, and applications in biology and medicine. Academic Press, London.
18. Mirelman D., (1986), Microbial lectins and agglutinins: properties and biological activity,John Wiley & Sons, New York.
19. Sharon N., Lis H., (2004), History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules. Glycobiology, 14, pp. 53R–62R.
20. Singh R.S.,Tiwary A.K., Kennedy J.F., (1999), Lectins: sources, activities and applications, Critical Reviews in Biotechnology,19, pp. 145–178.
21. Sharon N., Lis H., (2003), Lectins, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
22. Allen, N. K and Brillantine L., (1969), A survey of hemagglutinins in various seeds, Journal of immunology, 102, pp. 1295-1299.
23. Balzarini et al, (1991), Alpha-(1-3)- and alpha-(1-6)-D-mannose- specific plant lectins are markedly inhibitory to human immunodeficiency virus and cytomegalovirus infections in vitro,Antimicrob Agents Chemother, 35(3), pp. 410-6.
24. Nguyễn Thị Thịnh, Lê Doãn Diên, Nguyễn Quốc Khang và Phan Huy Bảo, (1983), Kết quả điều tra Lectin ở một số giống đậu ở Việt Nam, Tạp chí sinh học, 5(4), pp.11-18.
25. Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh, (1991), Tách tinh chế và một số tính chất của Lectin từ hạt chay A. tonkinensis,Tạp chí khoa học, 13(2), pp. 20-27.
26. Boyd W.C., Almodovar L.R., Boyd L.G., (1966), Agglutinins in marine algae for human erythrocytes. Transfusion (Philadelphia), 6, pp. 82–83.
27. Sudhir Kumar, Urmila Barros, (2012), Isolation of human erythrocyte agglutinins from marine algae, Journal of Natural Pharmaceuticals, 1 (1), pp.51-54.
28. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên, (2009), Cơ sở công nghệ sinh học_Tập 2: Công nghệ hóa sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng.
29. Barondes S.H., Cooper D.N., Gitt M.A., Leffler H., (1994), Galectin: Structure and function of a large family of animal lectin, Journal ofBiological Chemistry, 269, pp. 20807-10.
30. Ron J. D. and Slifkin, (1997), Methods in enzymology, Academic Press, 310, pp. 145-151.
31. Ofek I., Beachey E.H., (1987), Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli, Infect Immun, 22(1), pp.247–54.
32. Blunden G., Rogers D.J., Farnham W.F., (1975), Survey of British seaweeds for hemagglutinins,Lloydia, 38, pp. 162–168.
33. Blunden G., Rogers D.J., Farnham W.F., (1978), Hemagglutinins in British marine algae and their possible taxonomic value. In: Irvine DEG, Price JH (eds) Modern approaches to the taxonomy of red and brown algae,Academic, London, pp. 21–45.
34. Rogers D.J., Blunden G., Topliss J.A., Guiry M.D., (1980), A survey of some marine organisms for haemagglutinins,Botanica Marina,23, pp. 569–
577.
35. Hori K., Oiwa C., Miyazawa K. and Ito K., (1988), Evidence for wide distribution of Agglutinins in Marine Algae, Botanica Marina, 31, pp. 133-
138.
36. Fabregas J. et al, (1992), A comparative study of seafish erythrocytes and agglutinins from seaweeds, Comparative Biochemistry&Physiology,103A(2), pp. 307-313.
37. Chiles T.C., Bird K.T., (1989), A comparative study of animal erythrocyte agglutinins from marine algae. Comparative Biochemistry&Physiology, 94,
pp. 107–111.
38. Bird K.T., Chiles T.C., Longley R.E., Kendrick A.F., Kinkema M.D., (1993), Agglutinins from marine macroalgae of the south eastern United States,Journal of Applied Phycology, 5, pp. 213–218.
39. Ainouz L., Sampaio H., (1991), Screening of Brazilian marine algae for hemagglutinins,Botanica Marina,34, pp. 211–4.
40. Ainouz I.L., Sampaio A.H., Freitas A.L.P. et al, (1992), Agglutination of enzyme treated erythrocytes by Brazilian marine algae, Botanica Marina,35, pp. 475–9.
41. Freitas A.L.P., Teixeira D.I.A., Costa F.H.F. et al, (1997), A new survey of Brazilian marine algae for agglutinins, Journal of Applied Phycology, 9, pp. 495–501.
42. Alam M.T., Usmanghani K., (1994), Studies on marine algae for haemagglutinic activity,Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences,7, pp. 1–15.
43. Zheng Y., Lai-Sheng L., (2002), Screening of agglutinins in marine algae from Fujian coast of China,Chinese Journal of Oceanology and Limnology,
20, pp. 256–260.
44. Kumar S., Barros U., (2010), Human erythrocyte agglutinins from marine algae,Journal of Natural Pharmaceuticals,1, pp. 51–54.
45. Souza B.W.S.,Andrade F.K., Texeira D.I.A.,Mansilla A.,Freitas A.L.P., (2010), Haemagglutinin of the Antartic seaweed Georgiella confluens
(Reinsch) Kylin: isolation and partial characterization, Polar Biology, 33, pp. 1311–1318.
46. Hori K., Miyazawa K., Ito K., (1990), Some common properties of lectins from marine algae,Hydrobiologia 204-205, pp. 561–566.
47. Rogers D.J., Hori K., (1993), Marine algal lectins: new developments.
Hydrobiologia, 260/261, pp.589–593.
48. Teixeira E.H., Arruda F.V.S., da Silva B.R., do Nascimento K.S.,CarneiroV.A., Cavada B.S., Nagano C.S., Sampaio A.H., (2012), Biological applications of plants and algae lectins: An overview. In: Chang CF (ed) Carbohydrates—comprehensive studies on glycobiology and glycotechnology. In Tech, Croatia, pp. 533–558.
49. Hori K., Keisuke Miyazawa K. and Ito K. (1986a), Preliminary characterization of Agglutinins from seven marine algal species, Bulletin of the Japanese Society of Scientific, 52 (2), pp. 323-331.
50. Benevides N. M. B., Holanda M. L., Melo F. R., Freitas A. L. P. and Sampaio A. H., (1998), Purification and Partial Characterisation of the Lectin
from the Marine red alga Enantiocladia duperreyi (C. Agardh) Falkenberg,
Botanica Marina, 41, pp. 521-525.
51. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S., Costa F.H.F., Ramos M.V., (1999), A new isolation procedure and further characterisation of the lectin from the red marine alga Ptilota serrata. Journal of Applied Phycology, 10, pp. 539–546.
52. Oliveira S.R.M., Nascimento A.E., Lima M.E.P., Leite Y.F.M.M., Benevides N.M.B., (2002), Purification and characterisation of a lectin from the red marine alga Pterocladiella capillacea (SG Gmel) Santel & Hommers.
Rev Brasil Bot, 25, pp. 397–403.
53. Leite Marques Y.F.M., Silva Melo L.M.C., Amorim Neves R.C., Freire E. A., Jorge D.M., Grangeiro T.B., Benevides N.M.B., (2005), Purification of a lectin from the marine red alga Gracilaria ornata and its effect on the development of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus (Coleoptera: Bruchidae), Biochimica et Biophysica Acta, pp. 137-145.
54. Lima M.E., Carneiro M.E., Nascimento A.E., Grangeiro T.B., Holanda M.L., Amorim R.C. and Benevides N.M., (2005), Purification of a lectin from the marine red alga Gracilaria cornea and its effects on the cattle tick
Boophilus microolus (Acari: Ixodidae), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, pp. 6414-6419.
55. Hori K., K.Miyazawa and K.Ito, (1986b), Isolation and Characterization of Glyco conjugate-specific Isoagglutinins from a Marine Green Alga Boodlea coacta (Dickie) Murray et De Toni, Botanica Marina, 29, pp. 323-
328.
56. Hori K., Miyazawa K., Ito K., (1987), A mitogenic agglutinin from the red alga Carpopeltis flabellata,Phytochemistry, 26, pp. 1335–1338.
57. Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., (1998), A galactose-specific lectin from the red alga Ptilota filicina,Phytochemistry, 48, pp. 765–769.
58. Melo F.R., Norma M.B., Benevides N.M.B., Pereira M.G., Holanda M.L., Mendes F.N.P., Oliveira S.R.M., Freitas L.P., Silva L.M.C.M., (2004), Purification and partial characterisation of a lectin from the red marine alga
59. Okamoto R., Hori K., Miyazawa K., Ito K., (1990), Isolation and characterization of a new hemagglutinin from the red alga Gracilaria bursapastoris,Experientia, 46, pp. 975–977.
60. Ainouz I.L., Sampaio A.H., Freitas A.L.P., Benevides N.M.B.B., Mapurunga S., (1995), Comparative study on hemagglutinins from the red algae Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion triquetrum,R Bras Fisiol Veg, 7, pp. 15–19.
61. Kawakubo A., Makino H., Hirohara H., Hori K., (1997), The marine red alga Eucheuma serra J. Agardh, a high yielding source of two isolectins,
Journal of Applied Phycology, 9, pp. 331-338.
62. Nagano C.S., Moreno F.B.M.B., Bloch C., Prates M.V., Calvete J.J., Sampaio S.S., Farias W.R.L., Tavares T.D., Nascimento K.S., Grangeiro T.B., Cavada B.S., Sampaio A.H., (2002), Purification and characterization of a new lectin from red marine alga Hypnea musciformis. Protein Pept Lett, 9, pp. 159–165.
63. Mori T., O’Keefe B.R., Sowder R.C., Bringans S., Gardella R., Berg S.,