Tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus với các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ) bằng dung môi ethanol 20 %, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) 1:5 và nhiệt độ chiết 4 oC. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Xác định HTTS và HTR của từng DC. Kết quả được trình bày ở bảng 5 (phụ lục C) và hình 3.3.
Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiếtđến hoạt tính tổng sốvà hoạt tính riêng của
lectin. Hoạt tính tổng số ( ) và hoạt tính riêng ( ).
Kết quả từ bảng 5 (phụ lục C) và hình 3.3 cho thấy, sau thời gian chiết từ 1 đến 3 giờ, lectin chưa khuếch tán nhiều ra ngoài dung môi nên HTTS và HTR còn thấp. Từ 4 đến 8 giờ, HTTS của lectin đạt cực đại và không thay đổi (384 HU); HTR cũng đạt cực đại tại 4 giờ (52,2 HU/mg) nhưng bắt đầu có xu hướng giảm dần cho đến giờ thứ 8.
Như vậy, sau khi khảo sát một số yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình chiết lectin từ rong B. gelatinus, chúng tôi nhận thấy, quá trình chiết đạt hiệu quả tốt nhất với các điều kiện cụ thể như sau:
- Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:5 - Thời gian chiết:4 giờ
- Nhiệt độ chiết:4 oC 3.3 TINH CHẾ LECTIN
3.3.1 Khảo sát nồng độ ethanol để kết tủa lectin
Tiến hành kết tủa lectin ở các nồng độ % ethanol khác nhau:70, 80, và 90 % ở nhiệt độ tủa 4 oC, để qua đêm.
Thu nhận kết tủa bằng cách ly tâm dịch sau tủa ở 4 oC, tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút.
Sau đó, hòa tan tủa bằng dung dung đệm phosphate (PB 0,02M; pH = 7,5), ly tâm dịch sau khi hòa tan tủa ở 4 oC, tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút, thu lấy dịch trong.
Kết quả xác định HTTS, HTR và hiệu suất thu hồi của protein-lectin được trình bày trong bảng 6 (phụ lục D) và hình 3.4.
Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ % ethanol đến hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng
và hiệu suất thu hồi của lectin. Hoạt tính tổng số ( ) và hoạt tính riêng ( ).
Từ kết quả thu được, chúng tôi có nhận xét như sau, khi tăng nồng độ ethanol sử dụng thì HTTS, HTR và hiệu suất thu hồi lectin tăng dần. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ ethanol lên quá cao (từ 90 % trở lên) thì hiệu suất thu hồi lectin lại giảm xuống đáng kể (6,25 %).
Vì vậy, căn cứ vào HTTS, HTR, hiệu suất thu hồi và sự phân tích trên chúng tôi chọn ethanol với nồng độ 80 % để làm tác nhân tủa protein lectin từ DC rong B. gelatinus cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3.2 Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose
Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa giá trị A 280 nm và hoạt tính NKHC theo thứ tự các phân đoạn được trình bày ở bảng 7 (phụ lục E) và hình 3.5.
Hình 3.5 Đồ thịbiểu diễn sự tương quan giữa giá trị A 280 nm và hoạt tính ngưng
kết hồng cầu theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose. A 280 nm ( ) và hoạt tính ngưng kết hồng cầu ( )
Từ hình 3.5, chúng tôi ghi nhận được 1 peak có chỉ số A 280 nm cao, tập trung lượng protein mẫu chủ yếu.
Cũng dựa trên kết quả từ sắc ký đồ, tại peak này, hoạt tính ngưng kết hồng cầu được thể hiện rõ rệt nhất. Từ đó, có thể dự đoán rằng protein lectin cần tinh sạch được phân bố chủ yếu tại peak này.
Theo peak này, hoạt tính NKHC và hàm lượng protein tập trung chủ yếu ở các phân đoạn 46, 47, 48 và 49 nên chúng tôi tiến hành thu hồi các phân đoạn này để tiến hành chạy sắc ký lọc gel Sephacryl S-200.
3.3.3 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200
Các phân đoạn sau khi tiến hành sắc ký trao đổi có hoạt tính NKHC được tiến hành cô đặc bằng màng siêu lọc có kích cỡ 10kDa, sau đó được thẩm tách trong dung dịch đệm photphat PB 0,05M có chứa NaCl 0,15M; pH = 7 từ 2 đến 3 lần và tiến hành bước tinh sạch tiếp theo bằng sắc ký lọc gel trên nhựa Sephacryl S-200.
Tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 280nm và xác định hoạt tính NKHC của từng phân đoạn thu được. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giá trị A 280 nm, hoạt tính NKHC và thứ tự các phân đoạn.
Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel được thể hiện ở bảng 8 (phụ lục D) và hình 3.6.
Hình 3.6 Đồthịbiểu diễn độhấp thu A 280 nm và hoạt tínhngưng kết hồng cầu của các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200. A 280 nm ( ) và hoạt tính ngưng kết hồng cầu ( )
Từ hình 3.6 chúng tôi ghi nhận được 2 peak có chỉ số A 280 nm cao, trong đó lượng protein mẫu chủ yếu tập trung vào peak số II. Như vậy, theo dự đoán sơ bộ, hỗn hợp protein qua lọc gel gồm chủ yếu 2 loại protein có khối lượng phân tử khác nhau.
Cũng dựa trên kết quả từ sắc ký đồ, mặc dù hàm lượng protein được thể hiện ở 2 peak, nhưng chỉ có peak số II mới thể hiện hoạt tính NKHC một cách rõ rệt nhất, trong khi đó peak I lại không thể hiện hoạt tính NKHC. Từ đó, có thể dự đoán rằng protein lectin cần tinh sạch được phân bố chủ yếu tại peak số II này.
Trong peak số II, hoạt tính NKHC và hàm lượng protein tập trung chủ yếu ở các phân đoạn 30 - 43 nên chúng tôi tiến hành thu hồi các phân đoạn này để tiến hành chạy điện di.
3.3.4 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE
Tiến hành chạy điện di các dịch protein thu được qua từng bước tinh sạch trên gel polyacrylamide nồng độ 12,5 % với dòng điện ổn định có hiệu điện thế 100V. Thang protein chuẩn là những protein có trọng lượng phân tử từ 11 đến 190 kDa. Các bước tiến hành chạy điện di được trình bày ở mục 2.3.9. Kết quả thu được hiển thị ở hình 3.7.
Hình 3.7 Điện di lectin từ rong đỏ B.gelatinus. Dùng gel polyacrylamide 12,5 % (SDS – PAGE). Các dãi protein được nhuộm với Coomassie Brilliant blue R-250.Dãi 1:hỗn hợp
protein chuẩn (New England BioLabs Inc). Dãi 2:kết tủa protein bằng ethanol. Dãi 3:phân đoạn hoạt tính từ sắc ký trao đổi ion.Dãi 4:phân đoạn hoạt tính từ sắc ký lọc gel trong điều kiện không có chất khử.Dãi 5: phân đoạn hoạt tính từ sắc ký lọc gel trong điều kiện có chất khử β-mercaptoethanol.
Khối lượng phân tử của lectin từ rong đỏ B. gelatinus được đánh giá khoảng 19 kDa trong cả hai điều kiện khử và không khử, cho thấy rằng lectin tồn tại ở dạng monomer. Gel được nhuộm với thuốc thử periodic acid-Schiff (PAS) để phát hiện glycoprotein và không phát hiện dãi màu đỏ trong gel. Vì vây, lectin là một protein tồn tại ở dạng monomer.
3.3.5 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong
Betaphycus gelatinus
Tiến hành tinh sạch lectin từ rong B. gelatinus bằng các thông số thích hợp đã được khảo sát. Qua từng bước tinh sạch, tiến hành xác định hàm lượng protein và hoạt tính NKHC, độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi lectin. Dựa vào tên phân loài của rong, lectin từ rong B. gelatinus được đặt tên BGL.
Bảng 3.2 Kết quảtinh sạch lectin từrongB. gelatinustừ400 gam rong thô
Thể Protein HA HTTS HTR
tích tổng (HU/ml) (HU) (HU/mg)
(ml) (mg) Dịch thô 1400 1141 64 89600 78,528 Dịch sau 123 154,673 256 31488 203,578 kết tủa Dịch sau 490 69,584 32 15680 225,339 SKTĐ ion Dịch sau 540 17,743 8 4320 243,476 SK lọc gel MAC Độ ( g/ml ) tinh sạch (lần) 12,734 1 4,912 2,592 4,438 2,870 4,107 3,100
Qua các bước tinh sạch, chúng ta nhận thấy, HTTS cũng như protein tổng số của chế phẩm giảm đi đáng kể từ 89600 HU và 1141 mg xuống còn 4320 HU và 17,743 mg, tương ứng. Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất trong suốt quá trình tinh sạch.
3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH LÝ, HÓA CỦA LECTIN TỪ RONG
BETAPHYCUS GELATINUS
3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin
Để khảo sát nhiệt độ tối ưu của lectin từ rong Betaphycus gelatinus, lectin sẽ được xử lý ở các mức nhiệt độ khác nhau từ 20 oC đến 100 oC trong vòng 30 phút, sau đó làm lạnh nhanh và xác định hoạt tính NKHC của lectin với hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin.
Kết quả được trình bày trong bảng 9 (phụ lục F) và hình 3.8
Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tínhngưng kết hồng cầu của lectin từ
rong B. gelatinus.
Ởnhiệt độ 20 oC HTTS của lectin đạt giá trị cực đại. Khi tăng dần nhiệt độ từ 20 đến 60 oC thì hoạt tính của lectin vẫn không thay đổi. Nhưng khi
nhiệt độ tăng trên 60 oC thì hoạt tính NKHC bắt đầu giảm dần. Ở nhiệt độ 70oC, HTTS chỉ còn 16 HU và mất đi hoàn toàn khi nhiệt độ tăng đến 80 oC. Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao cấu trúc của phân tử bị biến tính, từ đó làm ảnh hưởng đến khả năng ngưng kết của lectin. Theo kết quả nghiên cứu của luận văn này cho thấy, lectin từ rong B. gelatinus là một lectin có độ bền nhiệt cũng giống như một số lectin từ rong biển khác, chẳng hạn lectin từ một số loài rong đỏ như E. serra, K. striatum, P. palmata, P. capillacea có khả năng chịu nhiệt với sự giảm dần hoạt tính khi được nung ở nhiệt độ trên 60 °C [56], [58], [71], [72].
3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin
Để tìm ra khoảng pH tối ưu cho hoạt động của lectin từ rong
B.gelatinus, tiến hành thẩm tách lectin trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng với các loại đệm có pH khác nhau từ 3 đến 10. Sau đó tiến hành thẩm tách một lần nữa với NaCl 0,15M để loại bỏ ảnh hưởng của pH.
Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong B.gelatinus được trình bày trong bảng 10 (phụ lục F) và hình 3.9.
Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tínhngưng kết hồng cầu của lectin từrongB.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính NKHC của lectin từ rong B. gelatinus không hề bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của pH, ở cả 3 môi trường axit, kiềm và trung tính.
Tính chất này cũng đã được nhận thấy ở một số loài rong khác như K. alvarezii và K. striatum hoạt động tốt trong khoảng pH từ 3 đến 10 [6], [14], hay rong E.serra không thay đổi hoạt tính trong khoảng pH từ 2,5 đến 10,5 [61]. Các nghiên cứu trên cũng tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của TS. Lê Đình Hùng cùng cộng sự vào năm 2012 [15], khi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của 8 loài rong thuộc vùng biển Ninh Thuận, Việt Nam. Kết quả từ nghiên cứu trên cho thấy, hầu hết hoạt tính NKHC của các lectin này đều không bị ảnh hưởng bởi pH, tiêu biểu như rong
B. composite và rong D.versluysii hoạt tínhtương đối của chúng đạt 100% trong khoảng pH từ 4 đến 9 [15].
Mặc dù hoạt tính NKHC của một số loài rong biển khác cũng bị ảnh hưởng khi pH môi trường thay đổi như rong T. crinitus (bị giảm hoạt tính trong môi trường axit mạnh và kiềm mạnh, khoảng pH tối ưu cho hoạt tính của chúng là từ 7 đến 8 [66]. Tuy nhiên, so với lectin từ thực vật bậc cao thì tính chất này cũng có sự khác biệt rõ rệt. Khi nghiên cứu về lectin từ thực vật bậc cao, người ta nhận thấy khoảng pH tối ưu cho hoạt tính NKHC là ở môi trường trung tính, axit yếu hoặc kiềm yếu. Hoạt tính NKHC của lectin từ mít na Artocarpus melinoxylus đạt tối ưu trong khoảng pH từ 6,5 đến 8, trong khoảng pH từ 4 đến 6 hay từ 8-10 khả năng NKHC của lectin giảm mạnh hoặc mất hoàn toàn [120].
3.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin
Tiến hành lấy 1ml dịch lectin cho tương tác với muối của các ion kim loại như: Ca2+, Mg2+ và EDTA ở nồng độ 50mM. Sau 2 giờ, các mẫu thí nghiệm được xác định hoạt tính NKHC và so sánh với hoạt tính NKHC của dịch lectin ban đầu (không tương tác với cation hóa trị II và EDTA) để đánh giá ảnh hưởng của cation hóa trị II và EDTA đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong B. gelatinus.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong B.gelatinus.
Mẫu Hoạt tính NKHC Hoạt tính NKHC tương đối
(HU/ml) (%)
Mẫu không kim loại 29 100
Ca2+ 29 100
Mg2+ 29 100
EDTA 29 100
Mặc dù nghiên cứu trên đây chỉ khảo sát sự ảnh hưởng của 2 ion kim loại là Ca2+, Mg2+ và EDTA đến hoạt tính NKHC của lectin từ DC rong B. gelatinus, nhưng kết quả bước đầu ở bảng 3.11 cũng đã cho thấy các tác nhân này không hề làm thay đổi khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu của lectin. Đây cũng là một trong những tính chất thường gặp của hầu hết các lectin từ rong biển, khi sự có mặt của các ion kim loại không làm ảnh hưởng đến hoạt tính NKHC của lectin, vì vậy việc nghiên cứu và ứng dụng các lectin này trong các lĩnh vực khác nhau sẽ có nhiều thuận lợi. Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu cho thấy, cũng có một số loài rong mà hoạt tính NKHC của chúng lại bị ảnh hưởng bởi ion kim loại như rong đỏ E. duperreyi [50] hay rong P. serrata [51].
3.4.4 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin
Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ B. gelatinus không bị ức chế bởi các đường đơn như D-glucose, D-mannose, D-galactose, D- xylose, N-acetyl-glucosamine, N-acetyl-D-mannosamine, N-acetyl- galactosamine, N-acetyl-neraminic axit glycoproteins như transferrin, asialo- transferrin và fetuin, nhưng bị ức chế mạnh bởi các glycoprotein mang dạng N-glycan high-mannose như yeast mannan và porcine thyroglobulin, chỉ ra rằng lectin này đặc hiệu cho N-glycan dạng high-mannose.
Bảng 3.4 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chếhoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong B. gelatinus (BGL)
Đường và glycoprotein Lectins
BGL KAA- KSA- EDA- ESA- HRLe
2a 2b 2c 2d Đường (mM) D-galactose -f - - - - - N-acetyl-D-galactosamine - - - - - - D-glucose - - - - - - N-acetyl-D-glucosamine - - - - - - D-mannose - - - - - - N-acetyl-D-mannosamine - - - - - -
N-acetyl neuraminic acid - - - - - -
D-xylose - - - - - - Glycoproteins (µg/mL) Transferrin - - - - - - Asialo-transferrin - - - - - >1000 Fetuin - 31.2 31.2 62.5 62.5 >1000 Asialo-fetuin 125.0 31.2 31.2 125.0 31.2 >1000 Yeast mannan 7.8 3.9 1.9 3.9 3.9 15.6 Porcine thyroglobulin 7.8 1.9 0.9 1.9 3.9 62.5
Porcine stomach mucin 125.0 - - - ND ND
Asialo-porcine stomach mucin 250.0 - - - ND ND Trypsin treated porcine stomach 250.0 - - - ND ND mucin
aLectin KAA-2 từrong K. alvarezzi[14] bLectin KSA-2 từ rongK. striatum[6] cLectin EDA-2 từrongE. denticulatum[7] dLectin ESA-2 từ rongE. serra[61] eLectin HRL từ rongH. renschii [121]
fKhông có sự ức chế đường (100mM) hay glycoprotein (2000µg/ml) ND không xác định.
Transferrin chỉ mang N-glycan dạng phức và fetuin mang cả hai N- glycan dạng phức và O-glycan đã không ức chế hoạt tính ngưng kết hồng cầu
của lectin này. Tuy nhiên, sự loại bỏ các gốc axit sialic của fetuin đã tăng hoạt tính ức chế so với fetuin ban đầu.
Porcine stomach mucin mang dạng O-glycan và dẫn xuất asialo của nó cho thấy hoạt tính ức chế. Sự loại bỏ gốc axit sialic của porcine stomach mucin không làm thay đổi hoạt tính ức chế, chỉ ra rằng các gốc axit sialic cuối cùng của chuỗi cacbohydrate trong porcine stomach mucin không ảnh hưởng đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin.
Yeast mannan mang N-glycan dạng high-mannose với liên kết (α1-6) trong cấu trúc lõi của nó và liên kết (α1-3) trong các chuỗi nhánh đã cho thấy hoạt tính ức chế mạnh, chỉ ra rằng lectin BGL có thể nhận biết các gốc mannose được liên kết ở vị trí (α1-6) và (α1-3) trong cấu trúc của yeast mannan (Hình 3.10).
Porcine thyroglobulin cho thấy hoạt tính ức chế sự ngưng kết hồng cầu