Mục tiêu chủ yếu để dự phòng thalassemia là làm hạn chế sinh ra thalassemia thể nặng [1].
Giáo dục sức khỏe cộng đồng, tư vấn di truyền đóng vai trò cơ bản. Sàng lọc người mang gen thal trước thai nghén và sàng lọc trước sinh. Hiện nay một số phương pháp mới trong chẩn đoán trước sinh được nghiên cứu, đó là chẩn đoán trước sinh không xâm lấn, lấy tế bào thai nhi và DNA thai nhi tự do trong máu mẹ để chẩn đoán trước sinh, hay chẩn đoán di truyền trước thụ thai, để thay thế cho phương pháp sinh thiết gai rau, lấy dịch ối [18].
Tại Việt Nam, trong 10 năm gần đây việc nghiên cứu đột biến gen đang phát triển, các kỹ thuật phát hiện đột biến gen ngày càng hoàn chỉnh, chẩn đoán trước cho bệnh nhi thalassemia bước đầu được áp dụng cho các cặp vợ chồng đã có con bị thal và cặp vợ chồng cùng mang gen bệnh [1], [22].
Đối với những gia đình có trẻ mắc thalassemia có nhu cầu sinh thêm con cần được triển khai được hệ thống sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh thalassaemia một cách thường quy ở phụ nữ có thai sẽ giúp nhận diện ra được những gia đình có nguy cơ cao sinh con mang gen bệnh thalassemia và quan trọng hơn, chẩn đoán trước sinh sẽ giúp chẩn đoán ra được những thai bị bệnh thể nặng để tư vấn cho gia đình đình chỉ thai sớm, đưa trẻ đi điều trị sớm ngay từ năm đầu đời hoặc làm thụ tinh trong ống nghiệm và xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi để chọn những phôi không bị bệnh đặt vào buồng tử cung người mẹ.
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Gồm tất cả các bệnh nhi mắc bệnh thalassemia điều trị tại Trung tâm Nhi khoa và khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên trong thời gian từ 01/07/2019 đến 01/12/2020.
Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhi từ 06 tháng đến 15 tuổi được làm xét nghiệm gen thalassemia.
Tiêu chuẩn loại trừ:
- Các bệnh nhi dưới 6 tháng.
- Gia đình bệnh nhi không đồng ý tham gia.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Từ 01/07/2019 đến 01/12/2020.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nhi khoa và khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu: Mô tả Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang
2.4. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
* Cỡ mẫu
Áp dụng công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu mô tả [10]:
n =
Trong đó:
α: Là mức ý nghĩa thống kê, chọn α = 0,05 Z1 - /2 = 1,96:Là hệ số giới hạn tin cậy.
chọn p = 0,029 (Nghiên cứu kiểu hình và kiểu gen ở bệnh nhi β-thal năm 2019 của tác giả Nguyễn Hoàng Nam) [22].
d: Khoảng sai lệch mong muốn là 0,05
Áp dụng công thức trên thu được kết quả như sau 43 bệnh nhi, thực tế thu thấp được 48 bệnh nhi.
* Phương pháp chọn mẫu
Chọn mẫu thuận tiện: Lấy vào nghiên cứu tất cả bệnh nhi nhập viện đáp ứng đủ tiêu chuẩn lựa chọn trong thời gian 01/07/2019 đến 01/12/2020 tại Trung tâm Nhi khoa và Trung tâm Huyết học, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
2.5. Biến số, chỉ số nghiên cứu
2.5.1. Các chỉ số nghiên cứu
- Tỉ lệ bệnh nhi theo giới
- Tỉ lệ giới tính của bệnh nhi theo thể bệnh. - Tỉ lệ bệnh nhi theo nhóm tuổi
- Tỉ lệ nhóm tuổi của bệnh nhi theo thể bệnh - Tỉ lệ lý do vào viện của bệnh nhi theo thể bệnh - Tỉ lệ biến dạng xương theo thể bệnh
- Tỉ lệ mức độ cần truyền máu theo thể bệnh
- Tỉ lệ đột biến gen ở bệnh nhi thalassemia theo dân tộc - Tỉ lệ đột biến gen theo các kiểu gen ở bệnh nhi
- Tỉ lệ alen đột biến của nhi β-thalassemia
- Tỉ lệ đột biến gen ở bệnh nhi β-thalassemia theo chức năng gan - Tỉ lệ kiểu gen gây bệnh α-thalassemia
- Chỉ số về GOT theo thể bệnh - Chỉ số về GPT theo thể bệnh
- Chỉ số về hình thái lách của bệnh thi theo thể bệnh - Chỉ số về hình thái gan của bệnh nhi theo thể bệnh - Chỉ số về huyết học theo thể bệnh
- Chỉ số hồng cầu theo thể bệnh - Phân bố nhóm máu theo thể bệnh
- Phân bố kết quả điện di huyết sắc tố theo thể bệnh - Phân bố mức độ thiếu máu theo thể bệnh
- Phân bố nồng độ hb theo thể bệnh - Phân bố nồng độ sắt theo thể bệnh
- Phân bố nồng độ ferritin huyết thanh theo thể bệnh - Phân bố nồng độ glucose máu theo thể bệnh
- Phân bố alen đột biến của bệnh nhi α-thalassemia
2.5.2. Các biến số nghiên cứu
- Giới tính: Chia làm 2 nhóm nam và nữ.
- Dân tộc: Chia ra làm 4 nhóm dân tộc Kinh, Tày, Dao và dân tộc khác. - Tuổi: Tính tuổi của trẻ theo tháng theo quy ước của WHO, chia làm các nhóm tuổi sau:
+ Nhóm 1: Từ 6 tháng đến <3 tuổi (tròn 6 tháng đến dưới 3 tuổi). + Nhóm 2: Từ 3 tuổi đến <6 tuổi (tròn 3 tuổi đến dưới 6 tuổi). + Nhóm 3: Từ 6 tuổi đến <9 tuổi (tròn 6 tuổi đến dưới 9 tuổi). + Nhóm 4: Từ 9 tuổi đến 15 tuổi (tròn 9 tuổi đến hết 15 tuổi).
* Tiêu chuẩn chẩn đoán thalassemia dựa vào lâm sàng
Tùy theo thể bệnh mà bệnh nhi có biểu hiện triệu chứng lâm sàng khác nhau từ thể không có triệu chứng lâm sàng đến thể có triệu chứng lâm sàng từ vừa đến nặng [13].
- Biểu hiện thiếu máu: Khám củng mạc mắt, khám da mặt, lòng bàn tay, lòng bàn chân và da cơ thể nơi được quần áo che phủ.
- Đánh giá lách to: Khám thực thể sờ thấy lách to [4]. + Lách to độ I: Lách to dưới bờ sườn 2 cm.
+ Lách to độ II: Lách to dưới bờ sườn 4 cm. + Lách to độ III: Lách to ngang rốn.
+ Lách to độ IV: Lách to quá rốn tới mào chậu. - Đánh giá gan to:
Khám thực thể xác định ranh giới vùng đục tuyệt đối của gan, kết hợp với sờ bụng để xác định bờ của gan. Ranh giới bờ trên của gan theo đường cạnh ức phải - liên sườn 5, theo đường giữa xương đòn phải - liên sườn 6, theo đường nách trước phải - liên sườn 7, bờ dưới của gan không vượt quá bờ sườn hoặc mũi ức cách đường ức phải 2cm [1].
+ Gan to ít: Dưới bờ sườn 1 - 2 cm. + Gan to vừa: Dưới bờ sườn 3 - 4 cm. + Gan to nhiều: Dưới bờ sườn 5 - 6 cm. + Gan rất to: Dưới bờ sườn >6 cm. - Đánh giá biến dạng xương sọ [1]:
+ Thăm khám lâm sàng thấy: vòng đầu to hơn bình thường, trán dô, mũi tẹt, biến dạng xương hàm, có bướu trán, bướu đỉnh.
+ Mức độ biến dạng xương sọ chia thành 2 mức độ:
● Nhẹ: chỉ có mũi tẹt.
● Nặng: ngoài mũi tẹt còn có bướu trán, bướu đỉnh và hàm vẩu.
* Chẩn đoán dựa vào cận lâm sàng
- Đánh giá mức độ sắt [33]: + Giảm: ≤6 µmol/l
+ Bình thường: 6 - 24 µmol/l + Tăng: ≥24 µmol/l
- Đánh giá thiếu máu: dựa vào chỉ số nồng độ Hb, gọi là thiếu máu khi nồng độ Hb máu <120g/l [17].
+ Thiếu máu nhẹ: 90 Hb <120g/l + Thiếu máu vừa: 60 Hb <90g/l + Thiếu máu nặng: 30 Hb <60g/l
+ Thiếu máu rất nặng: Hb <30g/l
- Điện di huyết sắc tố: Bệnh nhi được làm xét nghiệm điện di huyết sắc tố khi chưa truyền máu hoặc đã truyền máu trên 1 tháng [66].
Thành phần Hb bình thường của trẻ từ 1 tuổi trở lên: + HbA1: 94 - 96%
+ HbA2: 2 - 3,5% + HbF: 0,4 - 1,5%
Phân tích thành phần huyết sắc tố dựa trên máy điện di mao quản. Nhận định kết quả theo khuyến cáo của máy:
+ HbA1: 94 - 96% + HbA2 tăng khi >4% + HbF tăng khi >3%
+ HbE: trên điện di có HbE + HbH: trên điện di có HbH
Các bất thường khác: Trên hình ảnh điện di có các Hb bất thường như HbD, Hb CS…
- Ferritin huyết thanh [17]: + Bình thường: <300 µg/l. + Tăng nhẹ: 300 - 1000 µg/l. + Tăng vừa: 1000 - 2000 µg/l. + Tăng nặng: 2000 - 4000 µg/l. + Tăng rất nặng: >4000 µg/l.
Ferritin trên 1000 µg/l là nhiễm sắt.
Đo Ferritin huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch độ đục. Nguyên lý:
KN Ferritin + KT Ferritin phức hợp KN - KT (cố định trên hạt Latex). Đo độ đục của phức hợp KN - KT.
thay đổi theo tuổi. Trẻ nhỏ dưới 1 tuổi, số lượng hồng cầu còn giảm, nhất là lúc 6 đến 12 tháng, chỉ còn 3,2 đến 3,5 T/l. Nguyên do là ở thời kỳ này trẻ lớn nhanh, sự tạo máu tuy mạnh nhưng chưa đáp ứng; hệ tiêu hoá còn kém có thể thiếu một số yếu tố tạo máu. Từ trên 1 tuổi, số lượng hồng cầu ổn định dần. Từ trên 2 tuổi, số lượng hồng cầu ổn định trên 4 T/l. Bình thường, số lượng hồng cầu khoảng 4 ± 0,5 T/l .
- HCT: Là tỷ lệ hồng cầu trong máu toàn phần, tính theo %.
- MCV: Là kích thước trung bình hồng cầu, tính theo femtolit (fl).
- MCH: Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, tính theo picogam (pg). - MCHC: Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu, tính theo g/l.
- RDW: Độ phân bố kích thước hồng cầu, tính theo %.
Bảng 2.1. Khoảng tham chiếu các xét nghiệm huyết học [2]
HCT (%) RBC (T/l) MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/l) TB -2SD TB -2SD TB -2SD TB -2SD TB -2SD 6 tháng - 2 tuổi 36 33 4,5 3,7 78 70 27 23 33 30 2 - 6 tuổi 37 34 4,6 3,9 81 75 27 24 34 31 6 - 12 tuổi 40 35 4,6 4,0 86 77 29 25 34 31 12 - 15 tuổi Nữ Nam 41 43 36 37 4,6 4,9 4,1 4,5 90 88 78 78 30 30 25 25 34 34 31 31
enzym được gan tiết ra đảm nhận vai trò trao đổi amin, đồng thời tham gia các hoạt động chuyển hoá và tổng hợp cơ thể. Ngoài ra GOT còn được tìm thấy ở xương và tim. Đây là xét nghiệm được chỉ định đánh giá chức năng gan khi gan tổn thương.
+ Bình thường: 5 - 55 U/L + Tăng: >55 U/L
+ Giảm: <5 U/L [2].
- GPT: Còn gọi là Alanin aminotransferase (ALT), được tìm thấy trong huyết tương và trong nhiều tế bào của cơ thể nhưng phổ biến nhất là gan.
+ Bình thường: 5 - 50 U/L + Tăng: >50 U/L + Giảm: <5 U/L [2]. - Glucose: + Bình thường: 3,3 - 5,5 mmol/l + Giảm: <2,6 mmol/l + Tăng: >6,9 mmol/l [54]. - Kỹ thuật Multiplex PCR:
+ Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến.
+ Mục đích sàng lọc được các loại đột biến gen trong thalassemia sau:
● 6 loại đột biến phổ biến trong α-thal: SEA, THAI, α4.2, α3.7, HbCs, HbQs.
● 8 loại đột biến phổ biến trong β-thal: Codon 41/42, codon 17, codon 71/72, IVS I-5, IVSI-1, IVSII-654, codon -28, codon 26 (HbE).
+ Nguyên lý:
● Dựa trên đặc tính bổ sung nucleotit không tương hỗ ở đầu 3’ sẽ ngăn chặn sự kéo dài của mồi làm phản ứng PCR không thể xảy ra. Để xác định một đột biến cụ thể, cần thiết kế 2 đoạn mồi đặc hiệu cho ADN bình thường và 1 mồi đặc hiệu với ADN có đột biến. Mồi bình thường sẽ không gắn vào
đoạn ADN có đột biến và mồi đột biến sẽ không gắn vào đoạn ADN bình thường. Các sản phẩm PCR được điện di và so sánh kích thước với thang chuẩn ADN và các băng của chứng dương để xác định đột biến của mẫu [3].
● Nhận định kết quả: Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết [3].
Sơ đồ 2.1. Quy trình xác định đột biến gen cho bệnh nhi thalassemia
2.6. Phương pháp thu thập số liệu
PCR cho β-thal 8 loại ĐB phổ biến PCR cho α-thal 6 loại ĐB phổ biến PCR cho α và β-thal ● 8 loại ĐB β-thal ● 6 loại ĐB α-thal Bệnh β thal/Hb E EF EFA Bệnh HbH/Hb E EA Bart’s CS EA Bart’s Bệnh α thal/β thal/Hb E EF Bart’s CS EF Bart’s Bệnh HbH A2A Bart’s H A2ACS Bart’s H Bệnh β thal A2F A2FA Điện di huyết sắc tố Bệnh nhi Thalassemia
Các thông tin bao gồm đặc điểm chung, triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng, vấn đề điều trị của mỗi một bệnh nhi sẽ được ghi chép vào trong bệnh án nghiên cứu với các biến số nghiên cứu. Mỗi bệnh nhi sẽ có 01 bệnh án nghiên cứu riêng (Phụ lục 01).
Việc thu thập các thông tin về đặc điểm chung của bệnh nhi và các biểu hiện lâm sàng, cận lâm sàng dựa trên hồ sơ bệnh án kết hợp hỏi/phỏng vấn trực tiếp mẹ của bệnh nhi hoặc người làm nhiệm vụ chăm sóc chính của trẻ từ khi trẻ sinh ra - là người nắm rõ tiền sử của trẻ. Bản thân tác giả cùng các cán bộ của Trung tâm Nhi khoa và khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, các đồng nghiệp là học viên nội trú theo học tại khoa. Nhân lực tham giá nghiên cứu được tập huấn, thống nhất phương pháp thu thập số liệu.
Khám và chẩn đoán lâm sàng được thực hiện bởi các bác sĩ thuộc Trung tâm Nhi khoa, khoa Huyết học lâm sàng, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên thực hiện dựa trên các tiêu chuẩn chẩn đoán theo quy định.
Các xét nghiệm Sinh hoá, Huyết học:
- Địa điểm lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm được lấy bởi các kỹ thuật viên, điều dưỡng viên Trung tâm Nhi khoa, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
- Thực hiện phân tích kết quả: Xét nghiệm máu được thực hiện bởi các kỹ thuật viên, bác sĩ Trung tâm Huyết học, khoa Sinh hóa, khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên.
- Kỹ thuật lấy mẫu: Dựa trên quy định, hướng dẫn của Cục Y tế dự phòng - Bộ Y tế.
Kỹ thuật lấy mẫu máu: Chọn nơi lấy máu, xác địnhs vị trí tĩnh mạch. Các tĩnh mạch nổi không cần ga-rô. Khử trùng nơi lấy mẫu. Kiểm tra dụng cụ lấy mẫu. Đối với bơm kim tiêm: Kiểm tra pít tông bằng cách kéo và đẩy pít tông 2-3 lần. Điều chỉnh mũi kim tiêm sao cho đầu vát hướng lên trên. Đối với ống lấy mẫu chân không: Khi dùng ống chân không, đặt ống lấy mẫu vào dụng cụ
hỗ trợ, tránh đưa ống vượt quá vạch giới hạn của phần giữ ống tiêm để tránh việc mở phần chân không. Tiến hành rút máu: Đưa kim nhẹ nhàng vào mạch máu dưới một góc 30o.
- Quy trình tiến hành xét nghiệm Điện di huyết sắc tố:
+ Lấy bệnh phẩm: Lấy 1,5 – 2 ml máu toàn phần vào ống có chứa chất chống đông EDTA, cấp mã vạch trên phần mềm Labconn. Mẫu máu dùng cho xét nghiệm có thể bảo quản 7 ngày ở nhiệt độ 2 - 8 độ C, nhiệt độ phòng 15 - 30 độ C, tối đa là 72 giờ.
+ Khởi động máy điện di, chọn chương trình điện di hemoglobin trong phần mềm.
+ Xếp mẫu máu vào máy, đóng cửa phải của máy và máy tự động phân tích kết quả [3].
- Quy trình tiến hành xét nghiệm Multiplex PCR: