CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
- Các mẫu nước và bùn được thu thập ở một số vùng biển bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam bao gồm: Quảng Ninh, Thanh Hóa, Bình Định, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Vũng Tàu, … Mẫu được lưu trữ trong ống falcon 50ml tiệt trùng và được lưu trữ trong một hộp đựng nước đá trong thời gian vận chuyển, sau đó duy trì ở nhiệt độ 4oC ở Phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong vòng 24 giờ để phân tích. Dầu diesel và dầu thô được lấy từ giếng dầu Bạch Hổ (Vũng Tàu).
- 17 chủng VKTQH ban đầu đã được chọn từ bộ sưu tập của phòng Công nghệ sinh học môi trường, đó là: QP21, HQP304, DG12, DG217, LACM1, NMS25, DG218, LACM2I2, DG114, DG211, NMS411, VH, NMS412, DG213, MI1, A3II3 và DG214 được phân lập từ nước và trầm tích của những nguồn thải ở một số nhà máy và cơ sở sản xuất tại một số tỉnh miền Bắc như: Nhà máy Sơn Cầu Diễn, Hà Nội; Nhà máy Hóa chất Đức Giang và Công ty Xăng dầu khu vực I, Gia Lâm, Hà Nội; Cảng B12, Hạ Long, Quảng Ninh; Kho Vũ khí Bộ Quốc phòng; Nông trường Đồng Giao, Ninh Bình. Chủng MI1 đã được phân loại, thuộc chi Rhodopseudomonas và đặt tên là Rhodopseudomonas sp. MI1.
- Chủng Acinetobacter calcoacetius P23 có khả năng tạo màng sinh học tốt được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Đại học Hokkaido, Nhật Bản được sử dụng làm đối chứng dương cho khả năng tạo màng sinh học [124].
- Trình tự nucleotide của cặp mồi dùng khuếch đại đặc hiệu cho đoạn 16S rRNA Ramana và cộng sự đã sử dụng [125]:
27f primer: (5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 1527r primer: (5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′).
- Các chủng nghiên cứu trong luận án đều được nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ tối ưu 30 ± 2oC. Trong đó, công thức môi trường được sử dụng là DSMZ 27. Quy trình nuôi vi khuẩn được theo dõi dưới ánh đèn sợi đốt có công suất 60W với khoảng cách 20 cm.
- Giá thể: Vật liệu được chọn để làm giá thể cố định VKTQH dựa trên các điều kiện cơ bản như khả năng hấp phụ chất ô nhiễm, đồng thời cũng có các khoảng trống để VKTQH có khả năng cố định và phát triển trên đó. Từ các cơ sở trên, một số vật liệu có thể đáp ứng các điều kiện phù hợp với các VKTQH tạo màng sinh học cũng như điều kiện phòng thí nghiệm trong nghiên cứu này bao gồm ba loại là: xơ dừa, sỏi nhẹ và mút xốp (Bảng 2.1.)
Bảng 2.1. Các loại giá thể
Giá thể Hình ảnh Thông số kỹ thuật Hãng sảnxuất
Mút PU K40 (Polyurethane) - Quy cách: Dạng tấm - Trọng lượng riêng: 40kg/m3 Công ty cổ phần Đại Thành Sỏi nhẹ Keramzite - Cỡ hạt: 10- 20mm - Trọng lượng riêng: 650 kg/m3 Bemes Xơ dừa - Quy cách: dạng tấm - Trọng lượng riêng: 125kg/ m3 Công ty cổ phần sản xuất chế biến chỉ xơ dừa 25/8
2.1.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy
Hóa chất: Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất tinh khiết được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới như: Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic, v.v...
-Chuẩn bị cơ chất:
+ Các hợp chất hydrocarbon thơm hầu như đều ít tan trong nước, được pha trong acetone, bảo quản trong lọ tối màu và bảo quản trong tối, tránh ánh sáng mặt trời.
o Stock toluene 10.000 ppm: pha 200 μl toluene trong 20 ml acetone.
o Stock naphthalene 50.000 ppm: pha 0,5 g naphthalene trong 10 ml acetone.
o Stock pyrene 50.000 ppm: cân 0,5g pyrene hòa tan trong 10 ml acetone.
+ Dầu diesel, dầu thô nguyên chất được xử lý sơ bộ qua giấy lọc có kích thước lỗ 8 μm, hãng sản xuất Whatman – Anh.
Môi trường nuôi cấy
Môi trường DSMZ 27 ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar 18-20 g/l) được dung để để phân lập, nuôi cấy và giữ giống [126]. Môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
- Dung dịch vi lượng SL6(mg/l) [127]: H3BO3 0,3 g; MnCl2.2H2O 0,03g; CoCl2.6H2O 0,2g; ZnSO4.7H2O 0,1 g; CuCl2.2H2O 0,01 g; NiCl2.6H2O 0,02 g; NaMoO4.2H2O 0,03 g.
- Dung dịch vitamin B12: 10 mg trong 100 ml nước được khử trùng bằng màng lọc có kích thước lỗ 8 μm và bổ sung vào môi trường trước khi sử dụng (tỷ lệ 0,4 ml/l). - Môi trường DSMZ 27 cải tiến là môi trường DSMZ 27 trong đó nguồn carbon
được thay thế bằng các nguồn hydrocarbon khác nhau như phenol, naphthalene, pyrene, toluene ở nồng độ 50, 100, 150, 200, 250 và 300 ppm.
2.1.3. Các thiết bị máy móc
TT Tên thiết bị TT Tên thiết bị
1. Bình khí nitơ (Nga) 8. Tủ lạnh Samsung (Nhật Bản) 2. Bóng đèn sợi đốt Rạng Đông
60w
9. Tủ cấy vô trùng AVC-4A1(Esco, Singapore)
3. Cân phân tích Mettler toldo (Thụy Sỹ)
10. Máy đo quang phổ NOVASPEC II (Anh)
4. Nồi khử trùng ướt (Trung Quốc) 11. Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản)
5. Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ)
12. Kính hiển vi điện tử SEM, JSM- 840, Nhật Bản.
6. Máy điện di Powerpac 300 (Bio- Rad, Mỹ)
13. Máy đo pH (Thommas Scientific, Mỹ)
7. Máy hút chân không Speed- Vac 110A (Savant, Mỹ)
14. Máy ly tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi)