CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn tía quang hợp
Các bước tách chiết DNA tổng số được tiến hành theo mô tả trong nghiên cứu trước đây [125]. Cụ thể, 1 mL dịch nuôi cấy được ly tâm trong ống eppendorf để thu lấy phần sinh khối, sau đó rửa tế bào 2 lần bằng đệm natriphosphate (pH 8): bổ sung 300 μl NaPP, votex cho tan sinh khối và ly tâm ở 6500 v/ph trong 10 phút. Bỏ phần dịch nổi. Bổ sung 540 μl đệm tách (Tris-C1 1 M; EDTA 0,5 M; NaPP 1 M; NaCl; CTAB 1%), votex kỹ. Bổ sung 20 μl protease K (20 mg/ml), lắc ở 37oC trong 1 giờ đến 1 giờ 30 phút. Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 2 giờ. Protein được loại bỏ bằng một thể tích CI (Chloroform:Isopropanol) 24:1 (v/v), đảo nhẹ và ly tâm 12000 v/ph trong 15 phút. DNA được tủa bằng một lần thể tích isopropanol ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Ly tâm 12000 v/ph trong 15 phút ở 4oC, phần tủa là DNA genome được thu lại. Rửa tủa bằng 500 μl ethanol 70% (lạnh). Ly tâm 12.000 v/ph trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch. Tủa được làm khô bằng máy hút chân không. Tủa được hòa bằng nước deion khử trùng đã loại DNase với thể tích khoảng 25-30 μl. 2.2.2.2. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn 16S rRNA [125]. Cụ thể, các thành phần tham gia phản ứng PCR (25 μl) bao gồm 12,5 μl MasterMix 2X, 1,0 μl mồi 27f 10 mM, 1,0 μl mồi 1527r 10 mM, 2,0 μl DNA khuôn và 8,5 μl nước deion đã loại DNase. Chu trình nhiệt để tiến hành phản ứng PCR nhân gen 16S rRNA: 95oC - 5 phút, 30 chu kỳ của (95oC - 50 giây, 58oC - 45 giây, 72oC - 1 phút 30 giây), 72oC - 8 phút, 4oC - ∞.
Trình tự nucleotide của sản phẩm PCR được xác định bằng hệ thống đọc trình tự DNA tự động ABI (Mỹ) và được phân tích bằng phần mềm tin sinh Bioedit, Clustal X và Mega4.
2.2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Điện di DNA trên gel agarose được tiến hành theo phương pháp của Sambrook và Russel (2001). Gel agarose 1% được chuẩn bị, mẫu DNA được trộn với 2 µl loading dye và tra vào các giếng nhỏ và tra chỉ thị phân tử DNA chuẩn để xác định kích thước phân tử của mẫu DNA trên bản gel. Chạy diện di với điện thế
100V trong 35 phút. Sau khi kết thúc quá trình điện di, đưa bản gel vào nhuộm trong Ethidium Bromide trong 5 phút, bản gel được rửa lại bằng nước và mang đi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA và chụp ảnh [135]. 2.2.3. Nhóm phương pháp phân tích hóa học
Các thành phần hydrocarbon thơm có trong dịch nuôi cấy vi khuẩn được đem đi phân tích hóa học bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Agilent 1100 (Mỹ) được trang bị detectơ chuỗi (DAD). Điều kiện đo: cột sắc ký Hypersil C 18 (200 × 4 mm), tỷ lệ pha động axetonitril/nước = 67/33 (theo thể tích); tốc độ dòng: 0,6ml/phút; áp suất: 280 bar; tín hiệu đo phenol: 271 nm; toluene: 261 nm; naphthalene: 280 nm; pyrene: 336 nm. Hàm lượng phenol, toluene, naphthalene, pyrene được xác định theo phương pháp ngoại chuẩn.
Các mẫu phân tích được gửi phân tích tại viện Công nghệ mới – Viện Khoa học và Công nghệ quân sự.
Hàm lượng dầu diesel được xác định bằng phương pháp phân tích khối lượng theo tiêu chuẩn TCVN 4582-88:100 ml được hòa tan trong 15 ml dung môi chloroform, lắc nhẹ (khoảng 10 phút) cho dầu tan hoàn toàn (quá trình chiết được tiến hành 3 lần). Khi đó dầu và dung môi sẽ tách làm 2 lớp, dùng phễu chiết bỏ phần dung môi ở dưới đi. Phần dịch hòa tan còn lại được cô bay hơi bằng bếp cách cát cho tới cạn và cân khối lượng ta sẽ được khối lượng của lượng dầu. Quá trình thực hiện phân tích lượng dầu diesel còn lại trong dịch lỏng được tiến hành tại Viện Hóa Công Nghiệp.
2.2.4. Xử lý thống kê
Các kết quả, số liệu nghiên cứu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học. Dựa vào phần mềm Excel để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tính trung bình mẫu. Mức khác biệt có ý nghĩa thống kê được đề nghị là p<0,05.
Địa điểm nghiên cứu: Phòng CNSH môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3.1.1. Kết quả phân lập VKTQH từ các mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu
Để phân lập các chủng VKTQH tiềm năng có khả năng phân huỷ hydrocarbon dầu mỏ, các mẫu nước và bùn đã được thu thập tại các vùng biển Việt Nam. Các mẫu được làm giàu trong môi trường DSMZ 27 có bổ sung dầu diesel hoặc naphthalene, pyrene và anthracene. Sau đó, các bình nuôi VK được giữ trong điều kiện kỵ khí, ánh sáng tương đương 5000 Lux, nhiệt độ 30±2oC (Hình 3.1).
Theo dõi sau 5 - 7 ngày, màu sắc của môi trường làm giàu chuyển đổi rõ rệt sang màu đỏ tía, trên thành bình cũng quan sát có xuất hiện của các vệt màu. Kết quả này cho thấy có sự biểu hiện của VKTQH, thể hiện ở sắc tố quang hợp đặc trưng. Như vậy, dịch huyền phù trên các bình làm giàu được thu lại để tiến hành thí nghiệm phân lập các chủng VKTQH.
Trước Sau
Tiếp theo, các dịch làm giàu đã pha loãng được cấy trên môi trường thạch DSMZ 27 có bổ sung hydrocarbon dầu mỏ (toluene/pyrene/naphthalene/dầu diesel/ phenol/anthracene), tổng số 15 khuẩn lạc VKTQH đã bước đầu được tách riêng, làm thuần trên các môi trường thạch (Hình 3.2, Bảng 3.1). Trong đó, Hình 3.2 minh họa sự phát triển khuẩn lạc của chủng VKTQH được làm giàu từ mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ, trong khi Bảng 3.1 mô tả hình thái các khuẩn lạc VKTQH đã phân lập trong luận án này.
Hình 3.2. Một số khuẩn lạc VKTQH được phân lập từ mẫu làm giàu
Kết quả từ Bảng 3.1 cho thấy tại 15 khuẩn lạc VKTQH phân lập được tại vị trí ô nhiễm khác nhau có màu sắc, kích thước và hình dáng khuẩn lạc khác nhau và rất đa dạng. Màu sắc khuẩn lạc của chúng chủ yếu là từ đỏ nhạt đỏ tía đến đỏ đậm, từ nâu nhạt đến nâu đậm, vàng nhạt đến vàng đậm. Tại vùng biển Quảng Ngãi phân lập được nhiều chủng vi khuẩn nhất (8 chủng), vùng biển Vũng Tàu phân lập được ít chủng vi khuẩn nhất (2 chủng), Nha Trang - Khánh Hòa lập được 5 chủng (Cảng cầu đá 3 chủng và Làng chài 2 chủng). Trên nguồn cơ chất toluene phân lập được nhiều chủng nhất (4 chủng); tiếp theo trên pyrene phân lập được 3 chủng; trên napthalene, dầu diesel, phenol, anthracene mỗi nguồn cơ chất phân lập được 2 chủng. Toàn bộ 15 chủng VKTQH đã phân lập được tiếp tục được lưu giữ trong glycerol 20% ở điều kiện -20oC để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1. Kết quả phân lập các khuẩn lạc VKTQH từ nguồn mẫu nước bị ô nhiễm dầu mỏ ở các vùng biển Việt Nam
STT khuẩn lạcKý hiệu Hình ảnh khuẩn lạc Hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc
Nguồn cơ chất
Nguồn phân lập
1. (DD4)DQ41
Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, có rìa trong, không nhân, màu đỏ đậm, đường kính 1 - 1,5mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
2. DQ42
Khuẩn lạc tròn, lồi, rìa trong, loang, màu tím tía, đường kính 1mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
3. DQ51 Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, có rìaphẳng, màu đỏ tía, đường kính 0,5 mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
4. DQ52 Khuẩn lạc tròn, trơn, bóng, có rìa trong, màu đỏ tía, đường kính < 0.5mm
Toluene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
5. DQ81 Khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn bóng, rìa trong và phẳng, có nhân, màu đỏ
đậm, đường kính 2 - 2,5 mm Napthalene
Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
6. DQ82 Khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, có nhân,có chân, màu đỏ gạch, đường kính 1,5 mm
Napthalene Mẫu nước nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
7. FO1 Khuẩn lạc tròn, lồi, trơn, bóng, rìa loang, đỏ tía, đường kính 1 mm Dầu diesel Mẫu nước nhiễm dầu tạivùng biển Vũng Tàu
8. FO2 Khuẩn lạc tròn, trơn, rìa loang, đỏ nhạt, đường kính < 0,5 mm Dầu diesel Mẫu nước nhiễm dầu tạivùng biển Vũng Tàu 57
STT khuẩn lạcKý hiệu Hình ảnh khuẩn lạc Hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc
Nguồn cơ chất
Nguồn phân lập
9. DD3 Khuẩn lạc tròn, bóng, rìa trong, có nhân, đỏ nhạt, đường kính 1 mm
Phenol Mẫu bùn nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
10. DD4 Khuẩn lạc tròn, nhỏ li ti, màu đỏ nhạt
Phenol Mẫu bùn nhiễm dầu tại vùng biển Quãng Ngãi
11. PY2
Khuẩn lạc có nhân, lồi, tròn, bề mặt bóng, màu nâu vàng, đường kính 0.8-1.2 mm.
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
12. PY6 Khuẩn lạc có nhân màu nâu đậmhơn, mép loang, màu nâu vàng, đường kính 1.5 mm.
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
13. PY9 Khuẩn lạc màu hồng nhạt, cónhân, rìa trong, đường kính 1-2 mm.
Pyrene Cảng cầu đá Nha Trang - Khánh Hòa
14. LC1 Khuẩn lạc tròn, lồi, trơn, bóng,màu đỏ nhạt, rìa trong, đường kính 2-2.5 mm.
Anthracene Làng chài Nha Trang – Khánh Hòa
15. LC5
Khuẩn lạc hồng nhạt, có nhân màu đỏ, nhớt, có rìa, đường kính 5 mm.
Anthracene Làng chài Nha Trang – Khánh Hòa
3.1.2. Tuyển chọn các chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học và phân hủy hydrocarbon dầu mỏ
3.1.2.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Các chủng VKTQH sau khi được phân lập và làm sạch cùng 17 chủng VKTQH trong bộ sưu tập được tuyển chọn theo phương pháp 2.2.1.4 chương 2 được nuôi trong môi trường DSMZ 27 để đánh giá khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh học. Bảng 3.2 trình bày kết quả xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH phân lập được sau 7 ngày nuôi cấy:
Bảng 3.2. Khả năng sinh trưởng của các chủng VKTQH
STT Ký hiệu chủng ∆OD800 1. FO2 1.291±0.01 2. DQ52 1.283±0.012 3. DQ41 (DD4) 1.257±0.01 4. DQ42 1.25±0.02 5. DD3 1.228±0.03 6. DD4 1.222±0.01 7. DQ51 1.21±0.02 8. DQ82 1.19±0.012 9. FO1 1.163±0.01 10. DQ81 1.162±0.018 11. DG211 0.99±0.06 12. QP21 0.99±0.02 13. DG217 0.98±0.01 14. DG114 0.97±0.038 15. DG12 0.97±0.024 59
STT Ký hiệu chủng ∆OD800 16. PY6 0.97±0.023 17. LACM2I2 0.96±0.01 18. NMS412 0.95±0.023 19. A3II3 0.94±0.026 20. PY2 0.93±0.03 21. DG218 0.91±0.05 22. LC1 0.90±0.01 23. MI1 0.87±0.04 24. DG213 0.84±0.018 25. NMS25 0.82±0.02 26. VH 0.82±0.01 27. LC5 0.78±0.03 28. DG214 0.77±0.011 29. NMS411 0.76±0.01 30. PY9 0.74±0.01 31. HQP304 0.73±0.03 32. LACM1 0.71±0.01
Kết quả cho thấy, tất cả 32 chủng VKTQH đều sinh trưởng tốt trên môi trường DSMZ 27, trong đó có 10 chủng có kí hiệu là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 sinh trưởng tốt nhất (∆OD800>1).
Song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng của 32 chủng VKTQH chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng tạo màng sinh học.
Hình 3.3. Khả năng tạo màng sinh học dựa trên khả năng bắt giữ tím tinh thể của màng sinh học do các chủng VKTQH tạo thành
Hình 3.4. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng VKTQH phân hủy hydrocarbon dầu mỏ và Acinetobacter calcoaceticus P23 (K: đối chứng âm)
Kết quả tạo màng sinh học của 32 chủng VKTQH được so sánh với chủng chủng P23 là đối chứng dương [124] cho thấy 10 chủng là FO2, DQ52, DQ41, DQ42, DD3, DD4, DQ52, DQ82, FO1, DQ81 tạo màng sinh học tốt hơn so với chủng P23 là đối chứng dương có giá trị OD600 đạt 17,6 (Hình 3.3 và 3.4). Trong đó, bốn chủng VKTQH, bao gồm DQ41, DQ51, DD4 và DQ82 có khả năng hình thành màng sinh học mạnh, giá trị OD600 từ 20,6 đến 22,4 và tiếp tục tăng sau 7 ngày nuôi cấy (Hình 3.3 và Hình 3.4). Do đó, chúng tôi lựa chọn 10 chủng này để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2.2. Khả năng sử dụng hydrocarbon dầu mỏ của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng trên các nguồn hydrocarbon dầu mỏ của 10 chủng VKTQH có khả năng tạo màng sinh học tốt. Cụ thể, thí nghiệm
được thực hiện bằng cách thay thế acetate trong thành phần của môi trường DSMZ 27 bằng các cơ chất khác nhau, bao gồm dầu diesel, toluene, naphthalene, phenol và pyrene.
(i) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên dầu diesel
Kết quả cho thấy cả 10 chủng VKTQH đều ghi nhận có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường có bổ sung cơ chất dầu diesel nồng độ 4 – 8% (Hình 3.5, Hình 3.6), đáng chú ý nhất là 3 chủng DQ41, FO2 và DD4.
Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ dầu diesel khác nhau
Hình 3.6. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 10 % dầu diesel sau 7 ngày Cụ thể, dựa vào màu sắc dịch huyền phù và đo độ hấp phụ quang học dịch
huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm, các chủng VKTQH đã được lựa chọn đều có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dầu diesel với nồng độ từ 4 - 10% (v/v), tốt nhất trong khoảng 4 - 8% (v/v), chậm sinh trưởng ở nồng độ dầu 9 ÷ 10%.
(ii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên toluene
Toluene là một thành viên trong nhóm chất BTEX (gồm benzene, toluene, ethylbenzene và xylene), là nhóm chất ô nhiễm phổ biến trong các khí thải công nghiệp, nước thải của các nhà máy keo, dung môi, thuốc nhuộm [57]. Khả năng sử dụng toluene cũng được xem là một trong những tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về đặc tính của 10 chủng VKTQH trong luận án này.
Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào nuôi trong môi trường có bổ sung toluene ở các nồng độ khác nhau trong 7 ngày đo ở bước sóng 800 nm (Hình 3.7) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.8), chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 150 ppm chủng FO2 và DQ52 phát triển mạnh nhất (∆OD800 > 1), ở nồng độ 200 ppm chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), ở nồng độ 250 ppm chủng DQ41, FO2 và DD4 sinh trưởng mạnh (∆OD800 > 1), đến nồng độ 300 ppm OD sinh trưởng của cả 10 chủng đều bị giảm, đặc biệt là 3 chủng DQ52, DQ81 và DD82 (∆OD800 < 0,8). Ba chủng DQ41, FO2 và DD4 vẫn có thể sinh
trưởng khá tốt (0.9 <∆OD800 <1,0).
Hình 3.7. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH ở các nồng độ toluene khác nhau sau 7 ngày nuôi cấy
Trên thực tế, mức độ gây độc của toluene trong môi trường nước được chỉ ra là ≥ 50 ppm [136], như vậy nồng độ toluene 200 ppm là nồng độ cao, ức chế nhiều loài sinh vật. Do đó, 4 chủng DQ41, DD4, DQ52 và FO2 được chúng tôi lựa chọn là các chủng có khả năng sinh trưởng tốt trên toluene.
(iii) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên phenol
10 chủng VKTQH đã được nuôi cấy trong môi trường DSMZ 27 có bổ sung phenol với các nồng độ 150, 200, 250 và 300 ppm làm nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Sau 7 ngày nuôi cấy, khả năng sinh trưởng của các chủng được thể hiện ở Hình 3.9 và Hình 3.10.
Hình 3.9. Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH sau 7 ngày nuôi cấy ở các nồng độ phenol khác nhau
Hình 3.10. Dịch nuôi cấy của 10 chủng VKTQH ở 150 ppm phenol sau 7 ngày Dựa vào độ hấp phụ quang học dịch huyền phù tế bào ở bước sóng 800 nm màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.9) và màu sắc dịch huyền phù (Hình 3.10) chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ 150 ppm, hầu hết các chủng VKTQH đều có khả năng sinh
trưởng. Tuy nhiên, ở nồng độ 300 ppm, chỉ có ba chủng DQ41, FO2 và DD4 có khả năng sinh trưởng tốt.
(iv) Khả năng sinh trưởng của 10 chủng VKTQH trên naphthalene
Naphthalene là hợp chất PAH có độ tan khá cao trong nước nên sự có mặt của naphthalene trong nước gây độc rất lớn cho quần thể sinh vật. Cũng như các PAH khác, naphthalene khó bị phân hủy trong tự nhiên. Để đánh giá khả năng sinh