CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp phân tích vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp thu thập và bảo quản mẫu
Mẫu nước và bùn ô nhiễm dầu ở một số vùng biển bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam như: Quảng Ninh, Thanh Hóa, Bình Định, Quảng Ngãi, Khánh Hòa, Vũng Tàu, … theo TCVN 6663-1:2011 (ISO 5667-1:2006) và TCVN 7538-2:2005 (ISO 10381-
2:2002) có chỉnh sửa. Cụ thể, các bước lấy mẫu nước được tiến hành vào buổi sáng, nhiệt độ dao động từ 25-32oC. Mẫu nước sau khi thu thập được bảo quản trong ống falcon 50 ml, ghi thông tin đầy đủ và lưu trữ ở 4oC trong vòng 24 giờ để phân tích. 2.2.1.2. Phương pháp làm giàu các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Vi khuẩn tía quang hợp trong các mẫu đã được làm giàu theo phương pháp của Yamanaka và cộng sự (1983) có cải tiến, cụ thể: nuôi tích lũy trong các chai nhựa trong hình trụ có kích thước Ф = 5 cm, h = 35 cm. Các chai nhựa này được thiết kế theo kiểu cột Winogradsky. Các mẫu nước và bùn được đưa vào chai với tỷ lệ 1:1 (đối với các mẫu nước) hoặc 9: 1 (đối với các mẫu bùn) với thể tích môi trường DSMZ 27. Dầu diesel, naphthalene, pyrene hoặc anthracene (100 ppm) được bổ sung làm cơ chất, sau đó đậy kín để hạn chế sự có mặt của oxy (kỵ khí) và đặt dưới ánh đèn sợi đốt có công suất 60W (tương đương 5000 Lux), giữ ở nhiệt độ 30±2oC. Sau khoảng một tuần, các vạch màu từ nâu đến đỏ tía xuất hiên trên thành bình (là biểu hiện có sắc tố đặc trưng của VKTQH). Lấy mẫu từ vạch rồi tiến hành phân lập trên trên đĩa petri chứa môi trường thạch DSMZ 27.
2.2.1.3. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Phân lập các chủng vi khuẩn tía quang hợp được tiến hành theo phương pháp pha loãng dải nồng độ và cấy chang trên đĩa thạch [128]. Dịch pha loãng ở nồng độ 10-1 đến 10-10, lấy dịch pha loãng ở 10-3 – 10-6 cấy chang trên môi trường thạch DSMZ 27 (agar 2%) có bổ sung các hydrocarbon dầu mỏ nồng độ 50 - 300 ppm tương ứng với giai đoạn làm giàu. Các đĩa thạch được ghi rõ thông tin, sau đó nuôi trong điều kiện nhiệt độ tối ưu 30±2oC, ánh sáng tương đương 5000 Lux từ đèn sợi đốt, sau 2 ngày nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc tròn có màu nâu, hồng đến đỏ tía. Các khuẩn lạc này được làm sạch theo phương pháp cấy ria và tiến hành ủ mẫu dưới điều kiện kỵ khí sáng. Các chủng VKTQH đã được làm sạch được bảo quản ở -20oC trong glycerol lỏng [20% (v/v)] phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.1.4. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn tía quang hợp
Sinh trưởng của các chủng VKTQH đặc đánh giá bằng cách quan sát độ lớn khuẩn lạc khi mọc trên đĩa thạch hoặc xác định độ hấp phụ của dịch huyền phù tế bào tại bước sóng 800 nm (OD800) [129], vì trong tế bào vi khuẩn tía quang hợp Bchl có cực đại hấp thụ ở 800 nm và độ hấp thụ này tỉ lệ với hàm lượng Bchl và do vậy tỉ lệ thuận với sinh khối tế bào. Các chỉ số này được đo trên máy quang phổ Novaspec II hoặc máy quang phổ UV – 1650PC.
2.2.1.5. Phương pháp đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Để đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng đã lựa chọn, tiến hành nhuộm với tím tinh thể theo phương pháp của O’Toole và Kolter (1998), Morikawa (2006) và có cải tiến [130, 131]. Phương pháp nhuộm tím tinh thể giúp phát hiện ra các tế bào bám dính trong một màng sinh học trên bề mặt giá thể đồng thời cũng cho phép định lượng mức độ hình thành màng sinh học mạnh hay yếu trong một khoảng thời gian nhất định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng OD570. Chỉ số OD570 đo lượng tím tinh thể được giữ trong màng sinh học tỷ lệ thuận với mật độ tế bào sống trong màng sinh học.
Đối với PNSB một số bước được thay đổi như sau:
- Hoạt hóa các chủng làm màng sinh học: Nuôi cấy các chủng trên môi trường DSMZ 27 dịch. Sau từ 3-5 ngày nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4000 vòng/phút 4oC trong vòng 10 phút và rửa nước cất 2 lần với thể tích tương ứng). Sau lần ly tâm cuối cùng và hòa sinh khối trong 400 μl nước cất vô trùng. Pha loãng dịch sinh khối bằng nước cất vô trùng để đạt OD là 0,3. Bổ sung 100 μl dịch này vào các ống eppendorf 1,5 ml chứa 900 μl môi trường DSMZ 27. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Các mẫu được nuôi tĩnh dưới bóng đèn sợi đốt 60W và đánh giá khả năng tạo màng sinh học sau 7 ngày.
-Kiểm tra khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi sinh vật:
Dùng pipetman hút dịch nuôi cấy nhẹ không làm vỡ màng, rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 1 ml nước cất, hút loại nước, lặp lại lần nữa. Cho 1 ml dung dịch tím tinh thể 0,1 % vào các ống eppendorf, ủ 10 phút để cố định ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dung dịch tím tinh thể, rửa bằng 1 ml nước cất (2 lần). Bổ sung 1 ml dung dịch
axit axetic 33 %, đảo trộn hỗn hợp này, pha loãng tới hạn và đo OD ở bước sóng 600 nm. Các chủng VKTQH có chứa các sắc tố bacteriochlorophyll, vì vậy, bước sóng được sử dụng có sự thay đổi, không phải là 570 nm như trong các tài liệu [130, 131].
Công thức tính giá trị màng tạo thành:
Y = X x độ pha loãng x 10/3 Trong đó, X: là giá trị đo OD thu được;
10/3: là chỉ số quy đổi từ giá trị OD sang giá trị hấp thụ tím tinh thể của màng tạo thành).
Thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Chủng A. calcoacetius P23 được sử dụng làm đối chứng dương, ống eppendorf không chứa sinh khối VSV được chọn làm đối chứng âm [124].
2.2.1.6. Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp trên một số nguồn hydrocarbon khác nhau
VKTQH được đánh giá khả năng sinh trưởng trên một số nguồn hydrocarbon dầu mỏ, bao gồm toluene, naphthalene, phenol, pyrene và dầu diesel được bổ sung thay thế cho acetate trong thành phần của môi trường DSMZ 27 theo quy trình sau [79]:
- Các chủng vi khuẩn tía quang hợp đã hoạt hóa trong môi trường DSMZ 27 từ 3 – 5 ngày.
- Bổ sung 1 ml dịch sinh khối của mỗi chủng vào các ống penicillin (dung tích 12 ml) có chứa 9 ml môi trường DSMZ 27 cải tiến, nguồn cơ chất (tùy thí nghiệm) ở nồng độ 50, 100, 150, 200, 250 và 300 ppm; 4%-10% (dầu diesel). Các ống penicillin được đậy nút cao su kín, giữ bằng gông sắt và được đặt dưới ánh đèn sợi đốt (nhiệt độ 30±2oC, ánh sáng khoảng 5000 lux). Định kỳ mỗi ngày lắc nhẹ ống để cơ chất được phân bổ đều trong dịch nuôi cấy. Đối chứng là các ống penicillin chỉ chứa môi trường DSMZ 27 cải tiến bổ sung nguồn cơ chất.
- Dịch sinh khối thu được sau 7 ngày nuôi cấy được đo bằng máy quang phổ kế với bước sóng 800 nm để theo dõi mật độ tế bào.
2.2.1.7. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của của các chủng vi khuẩn tía quang hợp
Nhuộm Gram
Xác định Gram của vi khuẩn theo phương pháp của Smith và Hussey [132], sử dụng chủng vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Bacillus subtillis làm đối chứng.
Phương pháp xác định hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét
Hình thái hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét với sự phối hợp của phòng Vi sinh vật – Viện dịch tễ Trung ương, Hà Nội.
-Xác định hình thái tế bào của chủng VKTQH
Các chủng VKTQH được nuôi cấy trên môi trường DSMZ 27 thạch. Sau 2 ngày, lấy sinh khối tế bào cho vào ống eppendorf có chứa dung dịch cacodylate 0,1 M, đánh tan rồi ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút (2-3 lần). Cố định mẫu trong đĩa 6 giếng vô trùng bằng 2,5-3% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2-7,4 trong 1 giờ và rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1M (5 phút/ lần x 3 lần). Tiếp đó mẫu được cố định mẫu bằng OsO4 1% trong cacodylate 0,1 M trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng, rửa lại bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút/lần x 2 lần). Hút nước trong mẫu bằng cồn các nồng độ 50o, 70o, 80o, 90o, 100oC (5 phút/lần x 2 lần). Gắn mẫu trên giấy bạc, để khô, phủ mẫu bằng một lớp dẫn điện Pt – Pd và soi mẫu, chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử SEM, JSM-840, Nhật Bản.
-Xác định hình thái tế bào của các màng sinh học
Màng sinh học được chuyển lên tấm lamen có kích thước 1 cm2 (đã được nhỏ poly-L-lysine 0,1% (w/v) để cố định màng sinh học). Cố định mẫu trong đĩa 6 giếng vô trùng bằng 2,5-3% glutaraldehyte/cacodylate 0,1 M pH 7,2-7,4 trong 1 giờ và rửa bằng dung dịch cacodylate 0,1 M (5 phút/ lần x 3 lần). Thực hiện các bước thí nghiệm tương tự khi xác định hình thái tế bào của các chủng VKTQH ở trên.
2.2.1.8. Đánh giá mật độ tế bào của vi khuẩn tía quang hợp
Xác định mật độ tế bào VKTQH ở dạng tự do
Mật độ tế bào được xác định theo phương pháp pha loãng và cấy gạt trên môi trường thạch như sau: mẫu được pha loãng liên tục bằng nước cất vô trùng từ 10-1 đến 10-10. Dùng pipet vô trùng lấy 50 µl dung dịch ở các nồng độ pha loãng thích
hợp nhỏ lên bề mặt môi trường DSMZ 27 thạch và cấy gạt bằng que gạt vô trùng. Đặt các đĩa thạch trong điều kiện khí quyển nitơ (trong túi nilon, hút hết không khí và thay bằng khí nitơ), dưới ánh sáng đèn sợi đốt 60w, tiến hành đếm số khuẩn lạc sau 5 -7 ngày.
Số lượng khuẩn lạc (CFU) xuất hiện trên đĩa được đếm và tính theo công thức: CFU/ml = a ×(1/v)×n
Trong đó, n: là độ pha loãng mẫu;
A: là số khuẩn lạc đếm được trên bề mặt đĩa thạch; V: là thể tích mẫu được cấy, 1/v thể tích mẫu qui về 1 ml. Xác định mật độ tế bào VKTQH trên màng sinh học
Được tiến hành theo phương pháp của Allessandrello và cộng sự (2017) [133]. Màng sinh học trên sỏi nhẹ, xơ dừa và mút xốp (các giá thể được cắt thành các miếng nhỏ có kích thước nhất định (1 x 1 x 0,5 cm), đồng thời, các khối mút xốp có kích thước 5 mm) được rửa 2 lần với 5 ml NaCl 0,9% để loại bỏ tế bào phù du. Để tách tế bào, giá thể xơ dừa, sỏi nhẹ, mút xốp cho vào 5 ml dung dịch NaCl 0,9%, vortex trong 10 phút, sau đó pha loãng 10 lần. Hút 1 ml dịch pha loãng chang trên môi trường DSMS 27 thạch. Nuôi dưới ánh sáng 5000 lux, nhiệt độ 30±2oC, khí quyển nitơ. Sau 5 ngày khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tách riêng và được đếm tương tự như xác định mật độ tế bào VKTQH ở dạng tự do ở trên sẽ thu được mật độ tế bào trên màng sinh học. Logarit CFU/ml là giá trị mật độ tế bào mỗi chủng trên màng sinh học đa chủng, màng sinh học đơn chủng trên giá thể hoặc không gắn giá thể. Thí nghiệm này được lặp lại 3 lần.
2.2.1.9. Phương pháp nghiên cứu hệ sắc tố của vi khuẩn tía quang hợp
Phổ hấp thụ Bacteriochlorophyll ở trong tế bào nguyên được xác định theo phương pháp quang phổ ở vùng 400 – 900 nm trên máy quang phổ Novaspec II hoặc máy quang phổ UV – 1650PC.
2.2.1.10. Kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi khuẩn tía quang hợp được lựa chọn
Tính đối kháng của các chủng VKTQH được thực hiện theo mô tả của Khan và cộng sự, 2019. Cấy vạch các chủng VKTQH lên môi trường thạch đĩa DSMZ 27
cho các vạch cấy cắt nhau từng cặp một. Sự đối kháng của 2 chủng VKTQH thể hiện qua dấu hiệu gián đoạn tại các vị trí giao nhau của 2 vạch cấy [134].
2.2.1.11. Đánh giá khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ bởi màng sinh học của VKTQH
Tiến hành nuôi tạo màng sinh học với thể tích 10 ml môi trường DSMZ 27 trong bình trụ. Sau 7 ngày nuôi cấy (trong điều kiện kị khí, sáng) màng sinh học được tạo thành. Tiếp theo đánh giá khả năng phân hủy hydrocarbon dầu mỏ như sau:
⁻ Dùng pipeman hút dịch nuôi cấy nhẹ nhàng để tránh làm vỡ màng.
⁻ Rửa màng 2 lần bằng nước cất vô trùng với lượng thể tích tương ứng.
⁻ Bổ sung vào các bình trụ tương ứng gồm: 10 ml môi trường DSMZ 27 bổ sung 1ml/l vitamin [127] và các nguồn hydrocarbon các hydrocarbon dầu mỏ như phenol/naphthalene/toluene/pyrene tại các nồng độ khác nhau.
⁻ Nuôi tĩnh trong điều kiện kị khí, sáng.
⁻ Ngày thứ 14, tiến hành xác định hàm lượng hydrocarbon dầu mỏ trong mẫu thí nghiệm tại nồng độ mà VKTQH sinh trưởng tốt nhất (so với mẫu đối chứng không có VKTQH) bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) theo phương pháp 2.2.3.
2.2.1.12. Xây dựng mô hình và đánh giá hiệu quả xử lý hydrocarbon dầu mỏ của màng sinh học đơn chủng và màng sinh học do hỗn hợp các chủng tạo thành
Xây dựng mô hình
- Chuẩn vật liệu sử dụng làm giá thể với các tiêu chí về kinh tế, tính sẵn có, thân thiện với môi trường (mút xốp, xơ dừa và sỏi nhẹ), dụng cụ phục vụ cho việc chế tạo mô hình bao gồm: 4 bể nhựa có kích thước (Dài x rộng x cao: 35x26x15 cm), máy khuấy trộn, giống đơn chủng/đa chủng VKTQH, hóa chất pha môi trường.
Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sơ bộ các loại giá thể
- Cố định giá thể thành từng khối có diện tích bề mặt phù hợp với diện tích bề mặt bể sao cho tạo điều kiện thuận lợi nhất cho VKTQH có thể dễ dàng bám dính vào giá thể và tạo màng vi sinh.
- Bổ sung 90% môi trường DSMZ 27 và 10% đơn chủng/đa chủng VKTQH vào mô hình có sẵn giá thể và mô hình đối chứng không có giá thể đến khi thể tích đạt 5 lít. Đặt mô hình trong bể kính có đậy kín nắp hạn chế tiếp xúc với không khí (Hình 2.4).
- Đơn chủng/ đa chủng VKTQH bổ sung vào mô hình có giá thể: Lấy một lượng sinh khối giống nhau của các chủng DD4, DQ41 và FO2 cho vào trong 100ml môi trường DSMZ 27, hút 5 ml dịch huyền phù tế bào đo OD600, tiếp tục nuôi trong 72 giờ (ở nhiệt độ 30oC) để đạt được số tế bào VKTQH khoảng 2 × 109 CFU. Thực hiện theo cách tương tự đối với màng sinh học đơn chủng và đa chủng không gắn giá thể với số lượng tế bào ban đầu là khoảng 8 × 102 CFU mỗi chủng.
- Sau 7 ngày, tiến hành hút dịch lỏng trong bể mô hình, tránh tác động tới màng sinh học.
- Bổ sung môi trường DSMZ 27 không có acetate vào các bể vừa hút dịch lỏng đến thể tích 5 lít sau đó tiến hành bổ sung 500 ppm các loại hydrocarbon thơm (như toluene, phenol, naphthalene và pyrene), 17,2 g/l dầu diesel, 20 g/l dầu thô. - Khởi động hệ thống khuấy đảo dịch môi trường (nhẹ nhàng) với mục đích làm
cho các hydrocarbon thơm, dầu diesel, dầu thô được phân bố đều khắp giá thể làm tăng hiệu quả xử lý (giai đoạn 2 - Hình 2.5).
- Lượng cơ chất bao gồm các hydrocarbon thơm, dầu diesel, dầu thô đã bị hấp thụ bởi hỗn hợp chủng VKTQH, chỉ còn 1 lượng cơ chất rất nhỏ bám dính trên bề mặt giá thể (giai đoạn 3 - Hình 2.5).