Các loài vi nấm Penicillium oxalicum phổ biến ở cả môi trường trên cạn và biển, và các chất chuyển hóa thứ cấp của nó rất phong phú. Từ nhiều nghiên cứ u cho thấy thành phần các chất chuyển hóa của các chủng
Penicillium oxalicum thay đổi theo môi trường sống của chúng. Cụ thể, phân lập Penicillium oxalicum có nguồn gốc trên cạn thu được một hợp chất azo , một diterpene, adiphenylmethanone , spiro-oxindole alkaloid , isochroman carboxylic acid , và polyketides [132-134]; trong khi đố i vớ i loài có nguồ n gố c từ thực vâ ̣t thu được một số limonoids , butyrolactones , và isocoumarins [135-137]; cò n andalkaloid với các đơn vị 1,3-thiazole và 1,2,4-thiadiazole [138] được phát hiê ̣n từ loài có nguồn gốc động vật. Mặt khác, ngày càng có
26
nhiều chủng P. oxalicum có nguồn gốc từ biển được kiểm tra bằng hóa chất. Một loạt các chất chuyển hóa bao gồm chromones [139-141] từ các chủng có nguồn gốc động vật biển, men phenolic, meroterpenoids, và alkaloid từ các chủng có nguồn gốc thực vật biển [142-144] và axit secalonic, anthraquinon, alkaloids, và diphenylmethanone từ các chủng có nguồn gốc từ trầm tích biển đã bị biến tính [145-148].
Năm 2013, Shen và cộng sự đã phân lập được hợp chất chưa từng được báo cáo trước đây là 2-(4-hydroxybenzoyl) quinazolin-4 (3H)-one (1), cùng
với 2-(4hydroxybenzyl) quinazolin-4(3H)-one (2), rubinaphthin A (3),
citreorosein (4) và metyl 4-hydroxyphenylacetat (5) từ dịch chiết nuôi cấy của vi nấm biển P. oxalicum 0312F1. Các hợp chất 2 và 5 thể hiện hoạt tính ức chế sự nhân lên của TMV cao hơn, với giá trị EC50 tương ứng là 100,80 mg/mL và 137,78 mg/mL, trong khi hợp chất 1 và 2 cho thấy hoạt động ức
chế thấp hơn. Hơn nữa, hợp chất 1 cho thấy hoạt động ức chế sự gia tăng của tế bào ung thư dạ dày ở người SGC-7901 [149].
Cùng năm đó, nhóm nghiên cứu của Bao và cộng sự đã công bố phân lập được 2 polyketide chưa được mô tả trước đây là 6,8,5',6'-tetrahydroxy-3'- methylflavone (6) và paecilin C (7), cùng với sáu chất chuyển hóa được báo
cáo trước đây bao gồm emodin, citreorosein (4), axit secalonic D (8), axit
secalonic B (9), penicillixanthone A (10) và isorhodoptilometrin (11) từ môi
trường nuôi cấy của một loại nấm gắn liền với san hô gorgonian Penicillium sp. SCSGAF 0023 (P. oxalicum), được phân lập từ san hô gorgonian
Dichotella gemmacea được thu thập từ Biển Đông, Tam Á, Hải Nam, Trung Quốc. Các hợp chất 4, 6 và 11 cho thấy hoạt tính chống hà đáng kể chống lại sự định cư của ấu trùng Balanus amphitrite với các giá trị EC50 tương ứng là 6,7, 6,1, 17,9 và 13,7 µg / mL. Hợp chất 8-10 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với bốn chủng vi khuẩn được thử nghiệm bao gồm B. subtilis, E. coli
27
Hình 1.9: Cấu trúc hoá học của hợp chất 1-11 đã được công bố từ P. oxalicum
Cũng vào năm 2013, Sun và tập thể đã phân lập được hai dihydrothiophene-cromone ngưng tụ chưa được báo cáo trước đây, oxalicumones A (12) và B (13) và một sản phẩm tự nhiên mới oxalicumones
C (14) từ dịch chiết nuôi cấy của P. oxalicum SCSGAF 0023, được phân lập từ loài Muricella flexuosa gorgonian được thu thập từ Biển Đông. Hợp chất
12 thể hiện độc tính tế bào đối với các dòng tế bào A375 và SW-620 với IC50
28
P. oxalicum SCSGAF 0023, bởi cùng một nhóm nghiên cứu, đã dẫn đến việc phân lập hai chất tương tự mới dihydrothiophene-chromones ngưng tụ, oxalicumones D và E (15 và 16), cùng với oxalicumones AC (12-14),
coniochaeton A và B (17 và 18), este α-đa dạng (19) và este β-đa dạng (20). Tất cả các hợp chất phân lập được thử nghiệm về khả năng gây độc tế bào của chúng đối với tám dòng tế bào khối u ở người, H1975, U937, K562, BGC823, MOLT-4, MCF-7, HL60 và Huh-7, bằng phương pháp MTT. Hợp chất 16 và
12 cho thấy độc tính tế bào đáng kể đối với tám dòng tế bào được thử nghiệm
với IC50 ≤ 50 µM trong khi 13 thể hiện hoạt tính mạnh đối với U937, MOLT- 4 và HL60, với IC50 ≤ 10 µM [151].
Một nghiên cứu khác về nấm nội sinh có nguồn gốc từ rừng ngập mặn
P. oxalicum EN-201, được phân lập từ lá tươi của thực vật rừng ngập mặn biển Rhizophora stylosa thu thập từ đảo Hải Nam, Trung Quốc, đã thu ra hai ancaloit mới, penioxamide A (21) và 18hydroxydecaturin B (22). Hợp chất 21 và 22 cho thấy tôm ngâm nước muối (Artemia salina), với giá trị LD50 lần
lượt là 5,6 và 2,3 µM [152]. Năm 2015, Li và cộng sự đã công bố phân lập được một chất men phenolic mới, metyl (Z) 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2- formamidoacrylat (23) và một meroterpenoid mới, 15hydroxydecaturin A (24), cùng với WF-5239 (25) và bảy meroterpenoit khác bao gồm decaturin A (26), decaturin B (27), decaturin D (28), decaturin E (29), decaturin F (30),
oxalicine A (31) và oxalicine B (32) từ môi trường lên men của nấm nội sinh có nguồn gốc tảo biển P. oxalicum EN-290 được phân lập từ tảo xanh Codium mỏng manh, được thu thập từ Bờ biển Thanh Đảo, Trung Quốc. Tất cả các hợp chất phân lập được kiểm tra về hoạt tính kháng khuẩn chống lại hai vi khuẩn gây bệnh là S. aureus và V. parahaemolyticus, và hoạt tính chống HAB đối với các loài gây bệnh HAB Nitzschia closterium. Tuy nhiên, chỉ có hợp chất 23 hoạt động chống lại S. aureus và V. parahaemolyticus, với giá trị MIC tương ứng là 2,0 và 16,0 μg/mL, cũng như các hoạt động mạnh chống lại các loài gây bệnh HAB Nitzschia closterium với vùng ức chế 20, 16 và 10 mm ở nồng độ lần lượt là 20, 10 và 5 mg/mL [153].
29
Hình 1.10: Cấu trúc hoá học của hợp chất 12-32 đã được công bố từ P. oxalicum
Ở Viê ̣t Nam, nghiên cứu về thành phần hóa ho ̣c và hoa ̣t tính sinh ho ̣c của các hợp chất thứ cấp phân lập từ Penicillium oxalicum rất ít và còn nhiều hạn chế, đă ̣c biê ̣t là chủng nấm P. oxalicum có nguồ n gốc từ biển. Trong đó có nghiên cứu của Lê Thanh Hà và cô ̣ng sự đã sử du ̣ng Penicillium oxalicum
trong quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanaza phu ̣c vu ̣ cho việc ứng dụng vào sản xuất thu nhận chitooligosaccharit [154]. Vì thế nghiên cứu về thành phầ n hóa ho ̣c và hoa ̣t tính sinh ho ̣c của vi nấm biển là hướng nghiên cứu mới và đầy triển vo ̣ng nhằ m tìm ra mô ̣t nguồ n dược liê ̣u mới có nhiều ứng du ̣ng trong tương lai không xa.
30
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Chủng vi khuẩn
Chủng vi nấm Penicillium oxalicum CLC-MF05 có sẵn tại Viện Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Hoá chất và thiết bị nghiên cứu
Bột silica gel (Kieselgel 60, 230–400 mesh, Merck), Bột pha đảo C18 (ODS-A, 12 nm, S-150 m, YMC Co.,), bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) và RP-18 F254S plates (Merck), các dung môi CH2Cl2, MeOH, EtOAc, n- hexane, acetone, acetonitrile, môi trường PDB, thạch agar-agar, và các loại hóa chất, vật tư khác ...
Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong phương pháp thử hoạt tính bao gồm môi trường Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), môi trường Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, huyết thanh thai bò (FBS), và các thuốc thử nuôi cấy mô khác được mua từ Gibco BRL Co. (Grand Island, NY, Mỹ). Các kháng thể chính, bao gồm anti-COX-2, anti-iNOS, anti-β-actin của chuột/dê/thỏ và các kháng thể thứ cấp được mua từ Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Đức).
Các thiết bị nuôi cấy vi nấm như: tủ cấy an toàn sinh học cấp II (Esco, UK), tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật Bản), nồi khử trùng (Nhật Bản), tủ sấy và các thiết bị chuyên dùng khác.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi nấm
Chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05 được nuôi cấy bằng phương pháp cấy trải trên đĩa thạch, sử dụng môi trường PDA [155].
Môi trường PDA (1L) gồm:
NaCl : 25g
MgSO4 : 9g
CaCl2 : 1g
31
Agar : 30g
Môi trường được khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 15 phút.
2.3.2. Phương pháp lên men, tạo dịch chiết và phân lập các hợp chất
2.3.2.1. Phương pháp lên men, tạo dịch chiết tổng
Chủng vi nấm Penicillium oxalicum CLC-MF05 được lên men ở môi trường PDA trong 15 ngày ở 25oC. Sau đó, sinh khối vi nấm được chiết với EtOAc, và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng [155].
2.3.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất
Các hợp chất được phân lập bằng các phương pháp sắc ký kết hợp bao gồm các phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), sắc ký cột(CC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel (cỡ hạt 40 - 100 µM, Analtech) với hệ dung môi phân tách là n-hexan : ethyl acetate theo độ phân cực tăng dần. Sắc ký cột gel pha đảo C18 (cỡ hạt 35-75 µm, Analtech) được phân tách trên hệ dung môi methanol : H₂O theo độ phân cực giảm dần [156].
Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc kí lỏng hiệu năng cao được thực hiện trên hệ thống YL9100 (Young-Lin Co. Ltd., Korea), với bộ ghi tín hiệu Ultra Violet-Visible detector, cột điều chế Capcell C18 (20 x 150 mm; 5 µm; 3 mL/min) và YMC- Pack SIL-06 column (10 x 250 mm; 5 µm; 2 mL/min).
32
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên sự kết hợp giữa các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối lượng phun mù điện tử (ESIMS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), đo góc quay cực ([]D).
Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESIMS)
Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao thời gian bay (HR-ESI-TOF-MS) được thực hiện trên hệ thống ESI-Q-TOF- MS/MS system (AB SCIEX, USA)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR
Phổ NMR đo trên máy JEOL JNM ECP-400 spectrometer (JEOL, Japan) sử dụng tetramethylsilane (TMS) là chất chất nội chuẩn..
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HMQC, HMBC, COSY, và NOESY ...
2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm
2.3.4.1. Nuôi cấy tế bào và đánh giá khả năng sống sót của tế bào
Tế bào BV2 được nuôi cấy trong đĩa có đường kính 100 mm chứa môi trường DMEM và RPMI bổ sung 10% (v/v) FBS bất hoạt nhiệt, penicillin G (100 đơn vị/mL), streptomycin (100 μg/mL) và L-glutamine (2 mM) với nồng độ 5 x 10⁶ tế bào/đĩa ( 5 x 10⁵ tế bào/mL) và được ủ ở 37 ° C trong môi trường làm ẩm có chứa 5% CO2. Để xác định khả năng tồn tại của tế bào, tế bào được mạ trong đĩa 96 giếng (2×104 tế bào giếng) được ủ với 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) ở nồng độ cuối cùng là 0,5mg/mL trong 4 giờ. Muối formazan tạo thành được hòa tan trong axit hóa 2- propanol và mật độ quang của dung dịch được đo ở 590 nm bằng cách sử dụng đầu đọc vi tấm (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Các mật độ quang của formazan được hình thành trong các tế bào đối chứng (không
33
được xử lý) là được coi là đại diện cho khả năng tồn tại 100%. Thử nghiệm độc lập lặp lại ba lần [158].
2.3.4.2. Xác định nồng độ nitrite
Nitrite (NO₂⁻) được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100μL Griess reagent (50μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) acid phosphoric và 50μL 0,1% (w/v) n-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước. Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 20 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy ELISA plate reader ở bước sóng 525nm. Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
Nồng độ nitrite trong môi trường, một chất chỉ thị về sự tạo NO, được đo bằng phản ứng Griess. Ba thử nghiệm độc lập đã được thực hiện. Một phần của phần nổi phía trên (100 μL) được trộn với một thể tích bằng thuốc thử Griess (Dung dịch A: 222488, Dung dịch B: S438081; Sigma-Aldrich) và độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 525nm được xác định bằng cách sử dụng một liên kết enzym máy đọc đĩa xét nghiệm hấp thụ miễn dịch (ELISA) [159].
2.3.4.3. Xác định nồng độ PGE2
Mức độ PGE2 hiện diện trong mỗi mẫu được xác định bằng cách sử dụng bộ kit Elisa có sẵn từ Hệ thống R&D (Minneapolis, MN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thí nghiệm được lặp lại ba lần.
Các tế bào BV2 được nuôi cấy trong các đĩa 24 giếng, ủ trước trong 3 giờ với các nồng độ hợp chất khác nhau, và sau đó được kích thích trong 24 giờ bằng LPS. Các chất nổi nuôi cấy tế bào được thu thập ngay sau khi xử lý và quay ở 13.000 × g trong 2 phút để loại bỏ các chất dạng hạt. Các môi trường đã được thêm vào đĩa 96 giếng được phủ trước bằng chất làm sạch ái lực kháng thể đa dòng đặc hiệu cho PGE2. Một đa dòng liên kết với enzyme kháng thể đặc hiệu cho PGE2 được thêm vào giếng, để phản ứng trong 24 giờ, và rửa sạch để loại bỏ bất kỳ thuốc thử kháng thể-enzym không liên kết nào.
34
Sau việc bổ sung dung dịch chất nền, cường độ màu được tạo ra là được đo ở bước sóng 450 nm, tỷ lệ với lượng PGE2 hiện tại [158].
2.3.4.4. Phân tích Western blot
Tế bào BV2 được thu hoạch và cô lại bằng cách ly tâm ở tốc độ 16.000 vòng/phút trong 15 phút. Các tế bào khô được rửa bằng nước muối đệm phosphat (PBS) và ly giải với đệm Tris-HCl 20 mM (pH 7.4) chứa hỗn hợp chất ức chế protease (0,1 mM PMSF, 5 mg/mL aprotinin, 5 mg/mL pepstatin A và 1 mg/mL chymostatin). Nồng độ protein được xác định bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm protein Lowry (P5626; Sigma-Aldrich) và một lượng protein bằng nhau từ mỗi mẫu được phân giải bằng cách sử dụng điện di trên gel natri dodecyl sulfatpolyacrylamide 7,5% hoặc 12% (SDS-PAGE) và sau đó được chuyển điện di vào chất phát quang hóa học tăng cường Hybond ™ màng nitrocellulose (Bio-Rad). Màng đã bị chặn với sữa tách béo 5% (w/v) và được ủ tuần tự với kháng thể chính (Santa Cruz Biotechnology, CA, Mỹ) và kháng thể thứ cấp liên hợp peroxidase củ cải ngựa, sau đó phát hiện ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Mỹ). Các cường độ tín hiệu băng tần đã được định lượng bằng cách sử dụng phần mềm ImageJ (Viện Y tế Quốc gia, Bethesda, MD). Các marker trọng lượng phân tử và các chất nội chuẩn, β-actin và PCNA, cũng chạy trên gel. Phân tích được lặp lại ba lần [158].
35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nhân sinh khối và tạo cao chiết tổng chủng vi nấm
Penicillium oxalicum CLC-MF05
Vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05 được nuôi cấy trên môi trường thạch PDA chứa 3,0% muối biển trong bảy ngày. Sau đó bào tử của chủng nấm được chuyển vào 20 bình Erlenmeyer x 2000 mL, mỗi bình chứa 100 mL môi trường nuôi cấy và ủ ở 25°C trong 15 ngày. Môi trường PDA lên men và sợi bào tử nấm phát triển phủ kín bề mặt thạch. 20 bình lên men sau đó được chiết xuất ba lần bằng EtOAc để cung cấp dịch chiết hữu cơ sau đó được làm bay hơi để tạo ra dư lượng cao chiết nấm Penicillium oxalicum
CLC-MF05 (5.7 g). Phần cặn được rửa và lọc bằng metanol để tạo ra dung dịch hòa tan và phần cặn không hòa tan. Sau khi cô đặc, bằng các phương pháp phân tích hóa học cao chiết được phân tách để thu được các hợp chất thứ cấp. Sơ đồ tạo cao chiết tổng chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC- MF05 được thể hiện ở hình 3.1.
+ EtOAc
Đĩa nuôi cấy P.oxalicum
CLC-MF05
Dịch chiết EtOAc 3 lần 20 bình 2L x 100ml PDA
PDA lên men
25°C, 15 ngày
Cao chiết tổng EtOAc (5.7g)
Thu hồi EtOAc
36
3.2. Kết quả phân lập các hợp chất
Mẫu vi nấm P.oxalicum CLC-MF05 sau khi được lên men sinh khối lượng lớn và chiết với ethyl acetate thu được 5.7g cao chiết tổng. Cao chiết này sau đó được rửa và lọc bằng methanol để tạo ra dung dịch hòa tan và phần cặn không hòa tan. Sau khi cô đặc, phần hòa tan methanol (1.7 g) được đưa vào được đưa vào sắc ký cột C18 pha đảo ngược (RP) (CC, 5 x 26 cm), rửa giải gradient lần lượt với các tỷ lệ dung môi tăng dần của methanol (MeOH) trong H2O từ 20:80 đến 100: 0 để thu được sáu phân đoạn F1 - F6.
Phân đoạn F3 được phân tách bằng sắc ký cột Sephadex LH-20 CC, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH-H2O (4: 1, v/v) thu được 3 phân đoạn F3.1 –