Cột thủy tinh được nạp chất hấp phụ đến 2/3 thể tích Cột được rửa với dung môi nền là n-hexane trong 1 giờ nhằm ổn định cấu trúc Mẫu được nạp lên cột, thôi
n 22
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
mẫu bằng hỗn hợp dung dịch chloroform : acetone với tỷ lệ 10:1, 5:1, 0:1 Các phân đoạn thu được với tỷ lệ dung môi 5:1 được tinh sạch lần 2 bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ 6:1 [19, 22] Các phân đoạn được kiểm tra độ sạch bằng sắc kí bản mỏng
2 3 4 Sắc kí bản mỏng
Quá trình phân tách hỗn hợp các chất bằng sắc kí bản mỏng xảy ra khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh Các chất hấp phụ (pha tĩnh) được trải thành lớp mỏng trên tấm kính hoặc lớp kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo một tỷ lệ nhất định Trong quá trình di chuyển pha di động kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp mẫu di chuyển với tốc độ khác nhau tùy theo kích thước và độ phân cực của chúng, do đó tạo nên các băng vạch có giá trị Rf (Rf = khoảng dịch chuyển của cấu tử/khoảng dịch chuyển của dung môi) khác nhau trên sắc kí đồ
Trong nghiên cứu này, bản sắc kí silica gel 60 F254 được dùng làm pha tĩnh Pha động là hỗn hợp dung môi dichlomethane : methanol có tỷ lệ 96:4 Sắc kí đồ được hiện màu bằng phương pháp nhuộm iot
2 3 5 Xác định làm lượng malondialdehyde
Nguyên lý: Hàm lượng MDA được định lượng theo Ohkawa và cộng sự (1979)
[31] MDA là một trong những sản phẩm thứ cấp trong quá trình peroxy hóa lipid được gây ra bởi các gốc tự do Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp, chất này sẽ phản ứng với TBA (thiobarbituric acid) tạo ra hợp chất trimethine có màu hồng hấp phụ cực đại ở bước sóng 532-535 nm Đo độ hấp thụ của phức, suy ra hàm lượng MDA có trong mẫu Nếu lượng MDA giảm so với mẫu đối chứng, mẫu được xác định là có hoạt độ chống oxy hóa
Thành phần phản ứng xác định hàm lượng MDA: 300l dung dịch 8,1% SDS; 300 µl đệm 20% sodium acetate pH 3,5; 300 µl dung dịch 0,8% TBA; 80 µl dung dịch enzyme Hỗn hợp phản ứng được đun nóng 1 giờ ở 95C, sau đó làm lạnh Dùng hỗn hợp dung môi n-butanol : pyridine tỷ lệ 15:1 để chiết, lấy dịch trong màu
n
23
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
hồng đo ở bước sóng 532 nm Hàm lượng MDA được biểu thị bằng đơn vị đog/g tổ chức với hệ số tắt là = 1,56 x 105 mol-1 x cm-1 2 3 6 Xác định hoạt độ peroxidase 0 8 y = 0 9156x + 0 0408 0 6 0 4 0 2 0 0 R2 = 0 9916 0 0 0 2 0 4 0 6 0 8 -3
Hình 2 2 Đường chuẩn peroxidase
Nguyên lý: Hoạt độ peroxidase được xác định bằng phương pháp sử dụng
3,3-5,5-tetramethyl benzidine (TMB) làm cơ chất theo phương pháp của Josephy và cộng sự [21] Trong môi trường đệm phản ứng thích hợp có hydrogen peroxide (H2O2) và cơ chất TMB, H2O2 sẽ được khử thành H2O và oxy hóa cơ chất TMB tạo thành hợp chất có màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 492 nm Dựa vào đồ thị đường chuẩn có thể suy ra được hoạt độ peroxidase có trong mẫu cần phân tích (Hình 2 2)
Tiến hành: Thành phần phản ứng xác định hoạt độ peroxidase: 20 µl
0,6% TMB; 125 µl đệm 100 mM natri acetate pH 5,5; 50 µl dung dịch enzyme (50 µl nước cất cho đối chứng); 1 ml nước cất; 5 µl dung dịch 0,5% H2O2 Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 25C trong 15 phút Dừng phản ứng bằng 50 µl dung dịch 2 N H2SO4 Đo mật độ quang ở bước sóng 492 nm Hoạt độ peroxidase được biểu thị bằng đơn vị IU/mg protein
2 3 7 Định lượng protein
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [14] Phương
24
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2 3)
0 8 y = 0 0214x + 0 0414 0 6 0 4 0 2 0 R2 = 0 9914 0 5 10 15 20 25 30
Hàm lượng BSA (microgram)
Hình 2 3 Đường chuẩn Bradford với BSA làm chuẩn 2 3 8 Xác định khả năng ức chế vi sinh vật
Một khuẩn lạc được nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37C trong 2 ml môi trường lỏng qua đêm OD600 đạt 1-1,5 Dịch nuôi cấy (10l) được bổ sung vào 3 ml môi trường lỏng có chứa hoạt chất-mangostin với các nồng độ khác nhau (mẫu thí nghiệm), hoặc có chứa dung dịch dùng để hòa tan-mangostin (mẫu đối chứng), nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37C trong 24 giờ Dịch thử hoạt tính được pha loãng ở nồng độ 10-6, cấy trải trên môi trường đặc Sau khi ủ ở 37C qua đêm, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch Phần trăm ức chế của hoạt chất so với đối chứng được tính theo công thức:
Số khuẩn lạc ở mẫu thí nghiệm % Ức chế =
n
1-
Số khuẩn lạc ở mẫu đối chứng
25 X 100% O D ( 49 2 n m )
Hoạt độ peroxidase (10 IU)
O D ( 59 5 n m )
Luận văn thạc sĩ
Sinh học thực nghiệm
2 3 9 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của-mangostin
2 3 9 1 Phương pháp thử nghiệm trên chuột
-Mangostin được thử nghiệm trên đối tượng chuột nhắt trắng nhằm thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa
Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng, giống đực, thuần chủng, dòng Swiss, trưởng thành, khỏe mạnh, trọng lượng 22 2 g (n = 72) được chia ngẫu nhiên thành chia thành 6 nhóm (Bảng 2 5) Bảng 2 5 Các nhóm chuột xử lí hóa chất Nhóm ĐC TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 n 12 12 12 12 12 12 Cách xử lý
Uống dung dịch 0,9% NaCl Gây độc bằng cho uống CCl4
Gây độc bằng cho uống CCl4 + α-mangostin liều 0,1 mg/10 g TT Uống α-mangostin liều 0,1 mg/10 g TT
Gây độc bằng cho uống CCl4 + α-mangostin liều 0,2 mg/10 g TT Uống α-mangostin liều 0,2 mg/10 g TT
n: Số cá thể thí nghiệm
Nhóm ĐC: Nhóm chuột đối chứng uống 0,9% NaCl trong 14 ngày với liều lượng 0,1 ml/10 g thể trọng/ngày
Nhóm TN1: Nhóm gây độc được uống CCl4 trong 14 ngày [17]: hai ngày đầu uống hỗn hợp CCl4 : dầu ăn với tỷ lệ 1:7; mười ba ngày sau với tỷ lệ 1:5 Liều lượng 0,1 ml hỗn hợp/10 g thể trọng/ngày
Nhóm TN2: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm với α-mangostin liều lượng 0,1 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày
Nhóm TN3: Nhóm chuột chỉ uống α-mangostin liều lượng 0,1 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày
Nhóm TN4: Nhóm chuột gây độc bằng cho uống CCl4 có bổ sung uống thêm với α-mangostin liều lượng α-mangostin liều lượng 0,2 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày
n 26
Luận văn thạc sĩ
Sinh học thực nghiệm
Nhóm TN5: Nhóm chuột chỉ uống α-mangostin liều lượng 0,2 mg/10 g thể trọng/ngày trong 14 ngày
Trong quá trình thí nghiệm nhóm đối chứng và nhóm nghiên cứu đều được nuôi dưỡng cùng một điều kiện như nhau, hàng ngày được theo dõi, ghi chép diễn biến, cân trọng lượng Động vật thí nghiệm được uống hoạt chất vào một thời gian nhất định buổi sáng
2 3 9 2 Phương pháp lấy mẫu gan
Cho chuột nhịn ăn 24 giờ trước khi lấy mẫu thử Giết chuột bằng cách cắt đầu nhanh Mổ nhanh lấy gan và cân trọng lượng Cân 0,3 g gan rửa trong đệm lạnh (100 mM Tris-HCl; 250 mM sucrose, pH 7,4) để loại bỏ máu và catalase Sau đó được nghiền đồng thể trong cối chày sứ có cát thủy tinh và 300l đệm lạnh Dịch nghiền được ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4C Bỏ tủa, dịch trong được dùng làm các thí nghiệm xác định hoạt độ và định lượng
2 3 10 Xử lý số liệu
Phẩn mềm Microsoft excel được sử dụng để xử lý số lượng thu được trong quá trình thực nghiệm và tính các giá trị của các tham số thống kê, biệu thị bằng các biểu đồ thích hợp
n 27
Luận văn thạc sĩ
Sinh học thực nghiệm
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3 1 Tách chiết và tinh sạch-mangostin từ vỏ quả măng cụt
3 1 1 Tối ưu điều kiện tách chiết
3 1 1 1 Tối ưu dung môi chiết
1 2 1 2 3 4 5
0 8
0 4
0 0
α-mangostin
EP EtOAC EtOH MeOH
Dung môi chiết
(A) (B)
Hình 3 1 Tối ưu dung môi chiết (A): Sự phụ thuộc của lượng cao chiết vào loại dung môi chiết (B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt với các loại dung môi khác nhau (1): EP; (2): EtOAC; (3): EtOH; (4): MeOH; (5):-mangostin chuẩn
Sắc kí đồ dịch chiết vỏ quả măng cụt với các loại dung môi đã sử dụng đều cho một băng đậm có Rf = 0,5 cm, trùng với băng-mangostin chuẩn do hãng
Chromadex cung cấp (Hình 3 1B) Giá trị Rf = 0,5 cm của-mangostin khi TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt bằng hệ dung môi dichlomethane : methanol với tỷ lệ 96:4 cho kết quả tương tự với nghiên cứu của Misra và cộng sự (2009) khi sử dụng hệ dung môi chloroform : methanol với 9:1 có Rf = 0,46 cm [27] Sự chênh lệch nhỏ giữa hai giá trị Rf trên có thể là do sự khác nhau của các hệ dung môi được chọn làm pha động khi TLC Khi tách chiết bằng dung môi methanol (MeOH), lượng cao chiết thu được là cao nhất (Hình 3 1A) Tuy nhiên, hình ảnh sắc kí bản mỏng dịch chiết vỏ quả măng cụt bằng các dung môi trên cho thấy hàm lượng -mangostin trong dịch chiết bằng dung môi ethanol và methanol tương đương nhau (Hình 3 1B), điều này có thể do trong dịch chiết methanol còn có lẫn nhiều tạp
n 28
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
chất hơn dịch chiết ethanol Ngoài ra, với mục đích kinh tế và tính an toàn, dung
K h ố i lư ợ n g c ao c h iế t (g )
môi ethanol được chọn để tách chiết-mangostin
3 1 1 2 Tối ưu tỷ lệ dung môi
0 3 1 2 3 4 0 2 0 1 0 α-mangostin 1 5 2 5 3 5 4 5
Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
(A) (B)
Hình 3 2 Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết (A): Sự phụ thuộc lượng cao chiết vào tỷ lệ dung môi
(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu khác nhau (1):-mangostin chuẩn; (2) tỷ lệ 2: 1; (3): tỷ lệ 3:1; (4): tỷ lệ 4:1
Khi chiết bột vỏ măng cụt ở tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1 cho lượng cao chiết lớn nhất gần 0,25 g chiếm 12,5% trọng lượng nguyên liệu, và ở tỷ lệ 4:1 cũng cho lượng cao chiết gần tương đương (Hình 3 2A) Hình ảnh sắc kí bản mỏng dịch chiết vỏ quả măng cụt với tỷ lệ dung môi khác nhau cũng cho kết quả tương tự Dịch chiết bột vỏ quả măng cụt với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu khác nhau đều cho cho băng-mangostin có cùng Rf = 0,5 cm, và giống với băng-mangostin chuẩn Băng-mangostin ở tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1 và tỷ lệ 4:1 đậm tương đương nhau và đậm hơn ở tỷ lệ 2:1 (Hình 3 2B) Do đó, với mục đích tiết kiệm nguyên liệu đầu vào, tỷ lệ dung môi : nguyên liệu 3:1 được lựa chọn để tách chiết -mangostin từ vỏ quả măng cụt
3 1 1 3 Tối ưu thời gian chiết
Hình ảnh sắc kí dịch chiết bột vỏ quả măng cụt theo thời gian khác nhau đều cho băng tương tự với băng-mangostin chuẩn, có Rf = 0,5 cm Ở thời điểm 4 và 6 giờ băng này đậm hơn thời điểm 2 giờ và 1 giờ (Hình 3 3B) Kết quả này càng được
n 29
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
khẳng định khi khối lượng cao chiết ở thời điểm 4 giờ là cao nhất (Hình 3 3A) Do đó, để có hiệu suất tách chiết cao nhất và tối ưu quy trình, thời gian chiết là 4 giờ được chọn để tách chiết-mangostin từ vỏ quả măng cụt
K h ố i lư ợ n g c ao c h iế t (g )
0 14 1 2 3 4 5 0 1 α-mangostin 0 06 0 02 0 2 4 6 8
Thời gian (giờ)
(A) (B)
Hình 3 3 Tối ưu thời gian chiết (A): Sự phụ thuộc của lượng cao chiết vào thời gian chiết
(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt thu ở thời gian khác nhau (1): thời điểm 1 giờ; (2): 2 giờ; (3): 4 giờ; (4):-mangostin chuẩn; (5): 6 giờ
3 1 1 4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết
0 08 0 06 0 04 0 02 1 2 3 4 5 α-mangostin 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ chiết (độ C) (A) (B)
Hình 3 4 Tối ưu nhiệt độ tách chiết A): Sự phụ thuộc của lượng cao chiết vào nhiệt độ chiết
(B): TLC dịch chiết vỏ quả măng cụt thu ở các nhiệt độ chiết khác nhau (1): 30C; (2): 40C; (3): 50C; (4): 60C; (5):-mangostin chuẩn
n 30
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
Nhiệt độ tách chiết cũng là một yếu tố hết sức quan trọng trong qui trình sản xuất-mangostin Nó không chỉ ảnh hưởng đến hàm lượng-mangostin thu được mà còn quyết định đến nguồn nguyên liệu phục vụ cho quá trình tách chiết Vì vậy, khi sản xuất-mangostin ở qui mô công nghiệp cần chú trọng đến yếu tố nhiệt độ
K h ố i l ư ợ n g c ao c h iế t (g ) H à m l ư ợ n g c ao c h iế t (g )
tách chiết nhằm hạ giá thành sản phẩm Ở 50C và 60C lượng cao chiết thu được là cao nhất và tương đương nhau (Hình 3 4A) Tuy nhiên, khi sắc kí bản mỏng dịch chiết bột vỏ quả măng cụt thu được, kết quả cho thấy ở 60C có băng-mangostin đậm hơn ở 50C Do vậy, 60C được chọn làm nhiệt độ tách chiết-mangostin từ bột vỏ quả măng cụt
3 1 2 Tinh sạch-mangostin
1 2 3
α-mangostin
(A) (B)
Hình 3 5 Kiểm tra độ sạch của sản phẩm-mangostin tinh sạch
(A): TLC sản phẩm tinh sạch-mangostin qua cột silica gel (1):-mangostin tinh sạch; (2):-mangostin chuẩn; (3): dịch chiết trước khi đưa lên cột
(B): Kết quả kiểm tra độ sạch-mangostin bằng HPLC
Cao chiết chứa hoạt chất-mangostin được tách chiết từ 100 g bột vỏ quả măng cụt bằng dung môi ethanol với tỷ lệ dung môi : nguyên liệu là 3:1, ở 60C, sau 4 giờ Dịch chiết ethanol được tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp phân tách phân đoạn Cao chiết ethanol thu được chiếm đến 12,8% khối lượng nguyên liệu ban đầu (Bảng 3 1) Dịch chiết được sử dụng để tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel Lượng
n 31
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
-mangostin thu được sau khi tinh sạch chiếm 0,13% khối lượng nguyên liệu ban đầu Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự (2008), công bố tách chiết được lượng mangostin bao gồm-mangostin,-mangostin,
-mangostin chiếm 9,94% khối lượng nguyên liệu [35] Tuy nhiên, lượng -mangostin thu được ở đề tài này cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả:
Iinuma và cộng sự (1996) tách chiết được lượng-mangostin chiếm 0,0019% khối lượng nguyên liệu thô [19]; Ho và cộng sự (2002) thu được lượng-mangostin chiếm 0,006% nguyên liệu ban đầu Nguyên nhân có thể do hiệu suất thu hồi trong quá trình sắc kí cột silica gel không ổn định, và nguyên liệu có nguồn gốc khác nhau thì hàm lượng-mangostin cũng khác nhau Ngoài ra, ở đề tài này chỉ tập trung tinh chế-mangostin, nên khối lượng thu được sẽ thấp hơn trong nghiên cứu của Pothitirat và cộng sự
Bảng 3 1 Tỷ lệ sản phẩm tách chiết so với nguyên liệu thô Sản phẩm
Cao chiết ethanol Cao chiết n-hexan -Mangostin tinh sạch
So với nguyên liệu thô (%) 12,8
0,168 0,13
Sản phẩm thu được sau khi tinh sạch bằng cột sắc kí silica gel khá tinh khiết so với-mangostin của hãng chromadex Hình ảnh sắc kí bản mỏng sản phẩm tinh sạch cho thấy vẫn còn lẫn một băng có Rf = 0,92 cm (Hình 3 5A) Tuy nhiên, băng này rất mờ, chứng tỏ hàm lượng của chất này rất thấp Kết quả kiểm tra bằng HPLC cho thấy đô ̣ sa ̣ch của-mangostin đa ̣t 98,5% (Hình 3 5B) Sản phẩm tinh sạch được nhận dạng bằng phương pháp khối phổ, dựa vào phổ C13 và phổ H cho thấy sản phẩm này chính là-mangostin (Hình phụ lục P3 và P4) Như vậy, sản phẩm thu được đủ độ sạch và độ tin cậy để có thể sử dụng thử nghiệm các hoạt tính sinh học của-mangostin như: hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa trên đối tượng chuột nhắt trắng
n 32
Luận văn thạc sĩ Sinh học thực nghiệm
3 2 Hoạt tính kháng khuẩn của-mangostin
Hoạt chất-mangostin tinh sạch được bổ sung vào môi trường nuôi cấy các