Phần 3 ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh
thanh của gà ở đàn xảy ra bệnh.
Tiến hành phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà HI - Haemagglutination Inhibition Test (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2010) để kiểm tra hiệu giá kháng thể Newcastle trong huyết thanh của gà ở đàn xảy ra bệnh.
* Chuẩn bị
- Hồng cầu gà 1% (chế như trong phản ứng HA)
- Huyết thanh của gà trong đàn đang xảy ra bệnh Newcastle: Bắt ngẫu nhiên một số gà trong đàn đang xảy ra bệnh Newcastle, lấy máu chắt huyết thanh riêng từng con để kiểm tra hiệu giá kháng thể.
- Kháng nguyên chuẩn: Virus Newcastle đã biết (Virus vacxin chủng
Mukteswar) được xác định bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà và được pha ở hiệu giá chứa 4 đơn vị ngưng kết hồng cầu (4 đơn vị HA) để chắc chắn có ngưng kết khi làm phản ứng. Thí dụ virus vacxin chủng Mukteswar khi làm phản ứng ngưng kết hồng cầu, có hiệu gía ngưng kết là 1/256 (1 đơn vị HA) thì ở phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu này virus vacxin pha ở hiệu giá 1/64. Cách tính cụ thể: 1 đơn vị HA là 1/156 thì 4 đơn vị HA là 1/256 x 4
= 4/256 hay 1/64.
* Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được tiến hành trên tấm nhựa ngưng kết (Microplates) có 96 giếng đáy chữ U hoặc đáy chữ V.
Bảng 3.2. Sơ đồ tiến hành phản ứng HIÔ giếng số Ô giếng số Nguyên liệu Nước sinh lý (µl) Huyết thanh gà cần kiểm tra (µl) độ pha loãng HT Virus Newcastle chuẩn (4 đơn vị HA) (µl) Hồng cầu gà 1% (µl) Lắc đều, để yên 30 phút.
Dùng micropipet nhỏ vào các giếng, từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 8, mỗi giếng 25µl nước sinh lý. Sau đó cho vào giếng thứ nhất 25µl huyết thanh của gà cần kiểm tra hiệu giá kháng thể. Trộn đều rồi hút 25µl từ giếng thứ nhất sang giếng thứ hai. Trộn đều rồi hút 25µl từ giếng thứ 2 sang giếng thứ 3. Tiếp tục làm như vậy đến giếng thứ 8, trộn đều rồi hút bỏ đi 25µl. Như vậy huyết thanh của gà cần kiểm tra được pha loãng theo bậc 2 lần lượt từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 8 là : 1/2, 1/4 , 1/8, 1/16, 1/32. 1/64. 1/128, 1/256. - Cho 25µl dịch virus Newcastle chuẩn có hiệu giá 4HA vào tất cả các giếng từ giếng 1 đến giếng 8.
- Cho 25µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng.
- Lắc đều tấm nhựa ngưng kết, để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi đọc kết quả.
* Kết quả: Nếu trong huyết thanh của gà có chứa kháng thể Newcastle thì kháng thể này sẽ trung hòa virus Newcastle chuẩn, do đó không còn virus để làm ngưng kết hồng cầu gà.
Căn cứ vào hiện tượng ngưng kết hồng cầu của phản ứng, có thể xác định được hàm lượng kháng thể Newcastle có trong huyết thanh của gà. Hàm lượng kháng thể càng cao thì khả năng trung hòa virus càng lớn và ngược lại. Hiệu giá kháng thể trong phản ứng ngăn trở ngưng kết là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh có thể ngăn cản hoàn toàn sự ngưng kết hồng cầu của virus Newcastle. Ví dụ, hiện tượng gây ngưng kết chỉ bắt đầu nhận thấy ở giếng thứ 6 thì hiệu giá kháng thể là 1/64.