II. Công nghệ tạo động vật chuyển gen
2. Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp (fusion) với nhau. Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng. Do tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật trưởng thành sau này.
Ðối với động vật có vú, trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi loài hoặc bằng phương pháp nuôi cấy trứng trong ống nghiệm. Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.
Các phương pháp sử dụng hiện nay để chuyển gen vào tế bào chủ nói chung là hiệu quả không cao. Ðể tạo ra một động vật chuyển gen, yêu cầu cần phải sử dụng hàng trăm thậm chí hàng ngàn trứng thụ tinh. Ở bò để đạt được một lượng phôi lớn như thế, nó phải được kích thích để rụng một lượng lớn trứng (siêu rụng trứng) thành thục và được thụ tinh nhân tạo. Sự hiểu biết về sự kiểm soát chức năng buồng trứng tăng lên đang cải tiến hiệu quả để có đủ số lượng trứng thụ tinh. Việc kích thích gây siêu rụng trứng đòi hỏi sự hiểu biết một cách chi tiết các yếu tố hormone kiểm soát sự phát triển của trứng ở trong buồng trứng. Quá trình phát triển của trứng đã được nghiên cứu mạnh mẽ và đã đạt được một số kết quả trong những năm qua. Các nghiên cứu đã tập trung khảo sát các cơ chế cơ bản kiểm soát sự sinh trưởng và thành thục của trứng và chức năng của thể vàng. Chúng mở đường cho
sự phát triển các phương pháp điều hoà chu trình động dục để gây siêu rụng trứng một cách tỉ mỉ và chính xác hơn.
Có lẽ sự phát triển quan trọng nhất trong sinh lý học buồng trứng trong những năm mới đây là sự khám phá ra hormone inhibin. Inhibin là hormone ức chế sự rụng trứng, nó làm giảm tỉ lệ rụng trứng. Một vài giống động vật có tốc độ rụng trứng cao hiếm thấy như dòng Booroola của cừu Merino ở Úc có mức inhibin trong máu thấp. Trâu bò miễn dịch với inhibin có mức inhibin trong máu thấp và tăng tỉ lệ rụng trứng. Các gen kiểm tra sự sản xuất inhibin đã được tạo dòng và khả năng tạo ra động vật chuyển gen mà trong đó các gen này bị ức chế hoặc bị loại bỏ là hoàn toàn có thể.
Một quá trình nghiên cứu khác cũng đã được thực hiện để tìm hiểu các cơ chế kiểm soát điều hoà chức năng của thể vàng và sự sản xuất hormone progesterone của nó. Hormone này điều hoà thời gian chu kỳ động dục và giúp duy trì sự thụ thai. Sự hiểu biết này mở đường cho sự phát triển các phương pháp điều hoà chu kỳ động dục cho khớp với con mẹ thay thế và gây siêu rụng trứng. Sự xử lý gây siêu rụng trứng được bắt đầu khi hai buồng trứng chịu ảnh hưởng của progesterone. Hiện nay các xử lý gây siêu rụng trứng sử dụng các hormone có độ tinh khiết cao đựơc sản xuất bằng kỹ thuật DNA tái tổ hợp và đã tạo ra trung bình khoảng 10 trứng có thể phát triển đối với một lần xử lý (trong khi đó một con bò bình thường mỗi lần rụng trứng tạo ra 1 trứng có thể phát triển). Khi sự hiểu biết mới về các yếu tố kiểm soát sự phát triển của trứng và hoạt động chức năng của thể vàng được áp dụng, số lượng phôi có thể phát triển tạo ra sau một lần xử lý sẽ tăng lên như mong muốn.
Sự thành thục và thụ tinh nhân tạo của trứng đã tăng lên nhờ sự gây siêu rụng trứng, cung cấp một phương tiện khắc phục vấn đề sinh sản ít hiệu quả của vật nuôi. Thông thường một buồng trứng bò chứa khoảng 50.000 trứng chưa thành thục. Tuy nhiên, trung bình chỉ 3-4 trong số trứng này sẽ có kết quả trong việc sinh sản ra các bê con trong suốt thời gian sống của một bò mẹ. Sự sử dụng các phương pháp gây siêu rụng trứng hiện nay, từ một con bò đã xử lý có thể thu nhận được 10 trứng có thể phát triển và một nửa số trứng này phát triển thành phôi thích hợp cho chuyển gen. Kỹ thuật siêu rụng trứng cải tiến có thể dẫn đến sự tăng số lượng trứng thích hợp cho thụ tinh nhân tạo. Như thế số con sinh ra từ một động vật có thể hoàn toàn cao.
Sự thụ tinh nhân tạo chỉ xảy ra khi một tinh trùng đã chuẩn bị một cách đặc biệt để xâm nhập vào tế bào trứng gặp một trứng ở trạng thái thành thục tối ưu.
Ðối với cá, giai đoạn biến nạp thích hợp là phôi ở giai đoạn 1-4 tế bào. Giai đọan này được tạo ra bằng thu nhận trứng, tinh dịch bằng phương pháp sử dụng kích dục tố (kích thích tố trong nhau thai của người (HCG) hoặc não thuỳ thể cá chép...), rồi thụ tinh nhân tạo.
