b) Enzyme peptidase (hay cịn gọi là exopeptidase)
2.3.1.1. Mơi trường dinh dưỡng
Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của mơi trường nuơi cấy vi sinh vật là tính hồn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo amylase đều hấp thụ cacbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin,…), huydro ở dạng nước và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của mơi trường và ở dạng oxy phân tử..
Hàm lượng tinh bột trong mơi trường nuơi cấy khơng được ít hơn 20÷23%. Người ta thấy rằng khi hàm lượng tinh bột trong mơi trường giảm đi thì hoạt độ
của enzyme cũng sẽ giảm.
2.3.1.2. Độ ẩm của mơi trường
Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của mơi trường đối với
Aspergillus oryzae là 58÷70% và phải giữ cho mơi trường cĩ độ ẩm đĩ trong
suốt quá trình nuơi. Nếu độ ẩm tăng quá mức này thì sẽ làm giảm độ thống khí của mơi trường, cịn thấp hơn thì sẽ kì m hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo ra enzyme amylase. Cần nhớ rằng khi nuơi trong điều kiện khơng được vơ tr ùng tuyệt đối (tr ên các khay) thì độ ẩm của mơi trường sau khi cấy giống khơng được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dể bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ
được độ ẩm cao (nhằm phịng ngừa và hạn chế sự hong khơ của mơi trường) trong
suốt quá tr ình sinh tr ưởng của nấm sợi lại cịn cĩ ý ngh ĩa to lớn hơn vì khi bị hong khơ thì hoạt lực của enzyme sẽ giảm đi rất nhiều. Điều đĩ khẳng định sự cần thiết phải giữ ẩm cho mơi trường ở mức độ tối thích.
Cần thơng khí trong suốt thời kí sinh trưởng của vi sinh vật. Trong quá tr ình sinh trưởng của mình, vi sinh vật tiêu thụ khoảng 25÷35% chất dinh dưỡng của mơi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thơng giĩ với khơng khí vơ tr ùng. Chế độ thơng khí cĩ thể liên tục,
gián đoạn tùy thuộc vào chiều dày của lớp mơi trường nuơi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dãy khay. Thường là ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất phải thơng khí vào phịng nuơi khoảng 4÷5 lần thể tích khơng khí tr ên một thể tích
phịng trong một giờ, cịn ở giai đoạn thứ hai là 30÷60 thể tích khơng khí tr ên thể tích
phịng nuơi/1giờ, cịn lại ở giai đoạn thứ ba giảm đi chỉ cịn 10÷12 thể tích khơng khí mà thơi.
+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (10÷11 giờ đầu tiên). Trong thời kỳ này phải đốt nĩng khơng khí phịng nuơi khơng thấp hơn 23÷30oC. Độ ẩm tương đối của khơng khí là 96÷100%.
+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vịng 4÷18 giờ). Ở giai đoạn này nấm mốc hơ hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lớn. Kế t quả là trong lớp sợi nấm đang mọc, nhiệt độ sẽ tăng lên đến 37÷40oC, đơi khi tới 47oC. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phịng nuơi để sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi khơng khí vơ tr ùng cĩ nhiệt độ 28÷29oC và độ ẩm cao vào
phịng nuơi.
+ Thời kỳ tạo enzyme amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10÷20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt giảm mạnh. Các
enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn sinh trưởng thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Aspergillus
oryzae chỉ tạo được cĩ 7,5÷8% enzyme, trong vịng 12 giờ sau, hoạt lực của α –
amylase tăng 9÷12 lần, hoạt lực đường hĩa tăng hai lần và hoạt lực của oligo – 1,6 – glucosidase tăng lên 10 lần. Đối với đa số vi sinh vật ở giai đoạn này nên
hạ nhiệt độ xuống 3÷4oC so với giai đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc tr ên mối trường rắn là 28÷30oC.
2.3.1.4. Thời gian nuơi
Thời gian nuơi để vi sinh vật tạo ra lượng enzyme cao thường được xác định bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà cĩ thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng khơng mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus, sự tạo enzyme amylase cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.
2.3.2.1. Mơi trường dinh dưỡng
Khác với phương pháp nuơi cấy bề mặt, trong phương pháp nuơi cấy bề sâu người ta sẽ cho si sinh vật phát triển trong mơi trường lỏng. Thành phần dinh dưỡng của mơi trường lỏng thích hợp cho mỗi chủng vi sinh vật sẽ khác nhau.
Trong nhiều trường hợp, mơi trường để nuơi cấy bề sâu thường chứa tinh bột, các dạng bột và một số vật liệu khác làm nguồn cacbon. Chỉ một số ít chủng dùng nguồn cacbon là các đường dễ dàng đồng hĩa như glucose. Thực tế, trong một số trường hợp người ta đường hĩa sơ bộ tinh bột bằng amylase (trước khi thanh trùng). Khi đĩ maltose được tạo thành sẽ được đồng hĩa tốt hơn và so với tinh bột, maltose là chất cảm ứng tốt hơn của enzyme đường hĩa của nấm mốc.
Ngồi ra thể lỗng của mơi trường cuãng tốt hơn do độ nhớt của nĩ bị giảm xuống một cách sâu
sắc. 2.3.2.2.pH của mơi trường
Tr ị số pH ban đầu của mơi trường cũng cĩ thể gây ảnh hưởng nào đĩ đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đĩ cũng cần phải tính đến khả năng biến đổi nhanh chĩng chỉ số đĩ bởi vi sinh vật. Thơng thường đối với α – amylase, pH tối ưu cho sinh tổng hợp là khoảng 7÷8, khác với pH tối ưu cho hoạt động của nĩ là khoảng 4,7÷4,9.
2.3.2.3.Sục khí và khuấy trộn
Sự sinh trưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào lượng oxy phân tử h ịa tan trong dịch nuơi cấy. Trong quá tr ình sinh tr ưởng của mình, vi sinh vật sử dụng oxy
phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hịa tan trong mối trường lỏng phải luơn luơn được bổ sung. Chính vì lẽ đĩ, việc sục khí và khuấy đảo mối trường cĩ tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp các enzyme của vi sinh vật.
Nhiều cơng tr ình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuơi vi sinh vật (gồm nấm sợi, nấm men và vi khuẩn) tạo enzyme cĩ hiệu suất cao thì phải khuấy đảo
mơi trường bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt cả quá trình nuơi. Việc chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ cĩ tác dụng khá quyết định khơng chỉ đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện nuơi chìm mà cịn đối với sự sinh tổng hợp enzyme amylase nữa.
Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10÷12 m3 khơng khí vơ trùng (cĩ nhiệt độ khơng quá 40oC) trên 1m3 mơi trường trong một giờ với thời gian nuơi trong khoảng 68÷72 giờ. Với thời gian nuơi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống (48 giờ) và trong các thùng lên men sản xuất (48÷52 giờ) thì lượng khơng khí cần sục vào mơi trường để nuơi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15 phải là 30 m3/ m3 mơi trường/giờ đối với thùng nhân giống và là 40 m3/ m3 mơi trường/giờ đối với thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu trường để nuơi Aspergillus oryzae 3 – 9 – 15
tương ứng với 180 micromol O2/lít mơi trường (nồng độ oxy hịa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark). Chủng này cĩ vận tốc tiêu thụ oxy hịa tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng logarithm. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuơi vi sinh vật ưa nhiệt địi hỏi nhiều khơng khí hơn là nuơi vi sinh vật ưa ẩm. Nguyên nhân là do ở nhiệt độ tương đối cao (50÷65oC), độ hịa tan của oxy trong mơi trường giảm xuống, mặc dù nhu cầu của vi sinh vật ưa nhiệt về oxy cho các phản ứng oxy hĩa lại tăng lên.
Chương 3
NGGIỚUIY TÊHNI
ỆLUIỆ CUÁ VCÀ L
POHẠỤI GIA TRONG
CƠNG NGHỆ SẢN