Tinh d u c a v cây ầ ủ ỏ Phoebe zhennan có ho t tính b t g c t do DPPH t v i giá ạ ắ ố ự ốt ớ trị IC50 = 41,32 mg/mL. Điều này có th ể chứng t r ng tinh d u t v cây ỏ ằ ầ ừ ỏ Phoebe zhennan có th s d ng trong y h c, các s n phể ử ụ ọ ả ẩm chăm sóc sức kh e và m phỏ ỹ ẩm [46].
Năm 2017, Berna Elya và c ng s ộ ự[22] phân l p t ậ ừloài Phoebe declinata thu được h p chợ ất (100, 101)có ho t tính b g c t ạ ắt ố ự do DPPH đáng kể ớ v i giá tr ịIC50 lần lượt là 6,42 và 11,80 µg/mL.
1.4.5. M t s ộ ốhoạt tính khác
T d ch chi t methanol qu c a loài ừ ị ế ả ủ Phoebe chekiangensis Trung Qu c phân l p ở ố ậ
được b n h p ch t alkaloid bao g m: 5-hydroxy-ố ợ ấ ồ indoline (105), tyramine (106), N-norarmepavine (107) và tetrahydroisoquinoline analog SCH 71450 (108) được báo
26
D ch chi t ị ế ethanol c a v thân cây ủ ỏ Phoebe lanceolata cho th y kh ấ ả năng ạ đườh ng huy t ế đáng kểtrên chuộ ạt b ch tạng Thụy Sĩ trong vòng 18 gi liờ ở ều lượng 100 200 , và 500 mg/kg [43]. Ở Ấn Độ người ta dùng loài Phoebe laceolata p vđể đắ ết thương, vết loét [45].
Nhận xét chung : Các nghiên c u v thành ph n hóa hứ ề ầ ọc c a chi ủ Phoebe ở Việt
Nam còn r t ít. Ho t tính sinh h c c a các loài trong chi ấ ạ ọ ủ Phoebe đã được các nhà nghiên c u trên th ứ ế giới cũng như ở Vi t Nam báo cáo. Có th kể đếệ ể n m t s ho t tính ộ ố ạ quan tr ng c a chi Phoebe ọ ủ như gây c t độ ế bào ung thư, chống oxy hóa, kháng vi sinh v t, kháng khu n Vì v y, nh ng h p ch t trong chi ậ ẩ . ậ ữ ợ ấ Phoebe r t có tiấ ềm ứng d ng trong ụ việc chăm sóc sức kh e, làm thu c ch a b nh. Chính vì thỏ ố ữ ệ ế, trong tương lai thành phần hóa h c và ho t tính sinh h c c a chi này cọ ạ ọ ủ ần được ti p t c nghiên c u sâu r ng nhế ụ ứ ộ ằm khám phá các c u trúc và ho t tính m i, làm sáng t ấ ạ ớ ỏ cơ chế tác dụng cũng như mối liên h gi a c u trúc ho t tính c a các h p ch ệ ữ ấ – ạ ủ ợ ất. ỞViệt Nam loài Phoebe poilanei thuộc chi Phoebe cho đến nay có r t ít công b v thành ph n hóa hấ ố ề ầ ọc và ho t tính sinh hạ ọc c a ủ loài cây này. Vì vậy, đề tài này t p trung nghiên c u thành ph n hóa h c và hoậ ứ ầ ọ ạt tính gây độ ếc t bào in vitro của các h p ch t phân l p t ợ ấ ậ ừloài Phoebe poilanei Kosterm ở Vi t Nam. ệ
1.5. Vài nét v các hề ợp ch t flavonoid ấ
1.5.1. Khái ni m ệ
Flavonoid là m t nhóm h p ch t t ộ ợ ấ ự nhiên thường g p trong th c v t, ph n l n có ặ ự ậ ầ ớ màu vàng, chúng là h p chợ ất được c u t o gấ ạ ồm hai vòng benzen A và B n i vố ới nhau qua m t mộ ạch 3 carbon, có khung cơ bản là C6-C3-C6.
27
Flavan (2-phenyl chroman)
1.5.2. Phân lo [7, 11] ại
Hiện nay, có nhi u cách phân lo i khác nhau, cách phân loề ạ ại thường dùng là dựa vào v trí c a g c aryl (vòng B) v i các mị ủ ố ớ ức độ oxy hóa c a m ch 3 carbon. Flavonoid ủ ạ được phân thành các nhóm sau:
+ Eucoflavonoid: Flavon, flavonol, flavanon, flavanol, chalcon, antocyamin, anthocyanidin, auron.
+ Isoflavonoid: I flavon, isoflavan, isoflavanon. so + Neoflavonoid: Calophylloid.
1.5.2.1. Eucoflavanoid
Flavon
Đặc điểm c a flavon là có nhóm ketone v trí C-4 và m t liên kủ ở ị ộ ết đôi ở C-2và C- 3. V í và s ị tr ố lượng các nhóm hydroxyl liên k t v i các nguyên t cacbon c a khung ế ớ ử ủ t o nên các ch t khác nhau, ví d ạ ấ ụ như apigenin và luteolin. Flavon rất ph bi n trong ổ ế thực v t: Thông, hoàng c m (r ), mè (lá). ậ ầ ễ
28 Flavonol
H p ch t flavonol là nh ng ch t flavon có m t nhóm OH vợ ấ ữ ấ ộ ở ị trí C-3. Flavonol có r t nhi u trong th c v t và ph bi nh t là quercetin, myricetin, kaempferol và fisetin. ấ ề ự ậ ổ ế ấ
Flavanon
Đặc điểm c a flavanon là có m t nhóm ketone C-4 và không có liên kủ ộ ở ết đôi ở C-2, C-3. Flavanon thường ít g p trong t ặ ự nhiên, là đồng phân của chalcon và chúng đượ ổc t ng h p b ng ph n ng nhân t o và ph n ng sinh hóa. ợ ằ ả ứ ạ ả ứ Chúng thường n m trong ằ cân b ng h bi n v i chalcon do vòng dihydropyron c a flavanon kém b n nên d xằ ỗ ế ớ ủ ề ễ ảy ra m vòng t o thành chalcon. ở ạ
29
M t s flavanon ph bi n là naringenin, eriodictyol và hesperetin. ộ ố ổ ế
Dihydroflavonol
H p ợ chất dihydroflavonol là flavanon được g n nhóm th OH C-3. Các h p chắ ế ở ợ ất ở nhóm này ph n l n d ng aglycon, m t s ít d ng glycosit. Ngoài ra, chúng có hai ầ ớ ở ạ ộ ố ở ạ carbon bất đối ở C-2 và C-3 nên t o ra hai cạ ặp đôi đồng phân quang h c. Nh ng họ ữ ợp chất dihydroflavonol ph bi n nh t là: aromanderin, taxifolin và ampelopsin. ổ ế ấ
Flavanol
Đặc điểm c a h p ch t flavanol là không có nhóm ketone C-4 và liên kủ ợ ấ ở ết đôi ở C- 2 và C-3. Chúng được chia thành hai d ng: flavan-3,4-diols và flavan-3-ol. Catechin và ạ epicatechin được phân b r ng rãi trong thành ph n trà xanh. Chúng có th k t h p v i ố ộ ầ ể ế ợ ớ acid gallic t o ra để ạ epigallocatechin gallate hoặc epicatechin gallate.
30 Chalcon
Chalcon là nh ng h p ch t flavonoid m ch h ữ ợ ấ ạ ở trong đó có hai vòng thơm được liên k t v i nhau b ng nhóm carbonyl và liên kế ớ ằ ết đôi Cα=Cβ. S ố thứ ự t nguyên t ố được đánh bắt đầ ừ vòng thơm B. u t
Các h p chợ ất chalcon thường ít gặp trong t nhiên. Chalcon có th b ng phân ự ể ị đồ hóa thành flavanon khi đun nóng với hydrochloric acid (HCl).
Anthocyanidin
H u h t các màu sầ ế ắc như xanh lơ, tía, tím và những màu đã có sẵn trong nh a t ự ế bào hoa, qu , lá, thân là do các ch t màu anthocyanin ả ấ ở thể hòa tan. Nhưng chất màu
không có phần đường được g i là anthocyanidin. Cọ ấu trúc thông thường của anthocyanidin là ion flavilium (2-phenyl-benzopyrilium).
31
Tùy theo mức độ metyl hóa các OH trong vòng B c a anthocyanidin khác nhau mà ủ
có các d n xuẫ ất khác nhau. Ba đại diện điển hình là pelargonidin, cyanidin và delphinidin.
Auron
Auron là nhóm flavonoid có màu vàng sáng. Khung của auron cũng có 15C như những flavonoid khác nhưng dị vòng C ch có 5 c nh. S ỉ ạ ố lượng cũng như phân bố trong cây b h n ch . Chị ạ ế ất auron điển hình là aureusidin g p ph bi n trong m t s hặ ổ ế ộ ố ọ: Asteraceae (Cúc), Scrophulariaceae (Huyền sâm), Plumbaginaceae (Bạch hoa đan).
1.5.2.2. Isoflavonoid
Isoflavonoid bao g m nhiồ ều nhóm khác nhau và thường g p trong h ặ ọ Đậu
(Fabaceae). Trong isoflavonoid thì vòng B được thay th vào C-3 thay vì C-2 như ế trong các eucoflavanoid và được chia thành 3 nhóm chính sau: isoflavon, isoflavan và isoflavanon.
32 1.5.2.3. Neoflavonoid
Neoflavonoid chỉ có gi i h n trong m t s loài th c v t.Ví d ớ ạ ộ ố ự ậ ụ như brasilin có trong cây tô m c và calophyllolid có trong cây mù u. Khộ ung cơ bản vòng B được thay th ế vào v trí C-4 thay vì C-ị 3 như trong isoflavonoid.
1.5.3. Hoạt tính sinh h c c a flavonoid ọ ủ
Flavonoid là nhóm ch t ph bi n trong th c vấ ổ ế ự ật, thường có trong các lo i rau, cạ ủ, qu dùng hàng ngày. Flavonoid là m t l p ch t lả ộ ớ ấ ớn trong dược li u, ph n l n chúng có ệ ầ ớ màu vàng, ngoài ra còn có các chất màu xanh, tím, đỏ ho c không màu, chúng có nhiặ ều tác d ng sinh h c. ụ ọ
Trước h t, các d n ch t flavonoid là ch t ch ng oxy hóa, do có kh ế ẫ ấ ấ ố ả năng dậ ắp t t các
g c t ố ự do như OH, ROO (là các yếu t gây bi n d , h y ho i t ố ế ị ủ ạ ế bào, ung thư, tăng nhanh s lão hóa, ự vv...).
Đồng th i, flavonoid t o ph c v i kim lo nên ờ ạ ứ ớ ại ngăn cản các ph n ng oxy hóa mà ả ứ những ion đó là enzym xúc tác. Do đó, các chất flavonoid có tác d ng b o v ụ ả ệ cơ thể,
33
ngăn ngừa xơ vữa động m ch, tai bi n mạ ế ạch, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức x . ạ
c làm b n thành m ch, ch c, b o v
Flavonoid còn đượ ề ạ ống độ ả ệ chức năng gan. Ngoài ra nhi u flavonoid thu c nhóm flavon, flavanon, flavanol có tác d ng l i ti u rõ rề ộ ụ ợ ể ệt trong lá di p cá, cây râu mèo, ế vv…
Trên h tim m ch, nhi u flavoệ ạ ề noid như quercetin, rutin, mycicetin, h n hỗ ợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim.
34
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ỨC U
2.1. M u thẫ ực v t ậ
Các m u th c vẫ ự ật được thu th p tậ ại Tam Đường, Lào Cai, Vi t Nam trong tháng 4 ệ năm 2016. Tên khoa học được xác định là loài Phoebe poilanei Kosterm b i Tiở ến sĩ
Bùi Văn Thanh, Vi n Sinh thái và Tài nguyên sinh v t, VAST. M t m u tiêu b n ệ ậ ộ ẫ ả (NCCT-P28) được lưu trữ ạ t i Vi n Hóa sinh bi n, VAST. ệ ể
2.2. Phương pháp chi t ế
Dung môi
Các chất trong dược liệu có độ phân c c khác nhau. ự Trong đó gồm nh ng thành ữ phần tan trong nước và không tan trong nước. Các thành phần tan trong nước ít được quan tâm hơn so với nh ng thành ph n ữ ầ không tan trong nước. Vì vậy, các dung môi s ử d ng trong quá trình chi t phụ ế ải đượ ực l a ch n c n th n. Dung môi cọ ẩ ậ ần hòa tan được
các ch t th cấ ứ ấp đang nghiên cứu, d ễ dàng được lo i b , không ph n ng v i chạ ỏ ả ứ ớ ất nghiên cứu, ít độc.
Dung môi được s d ng cử ụ ần được chưng cấ ạch trướt s c khi s d ng. N u s d ng ử ụ ế ử ụ dung môi không s ch s gây ạ ẽ ảnh hưởng đến hi u su t và chệ ấ ất lượng c a quá trình chi t. ủ ế M t s ộ ố chất như diankylphtalat, tri- -butyl-n axetylcitrat, tributylphosphat có thể ẫ l n vào dung môi trong quá trình chi t hay b o qu n. Các ch t này s làm sai quá trình phân ế ả ả ấ ẽ tích và xác định c u trúc c a ch t c n nghiên c u. Nghiên c u này, chúng tôi s d ng ấ ủ ấ ầ ứ ứ ử ụ dung môi là methanol để chi t m u th c v t. ế ẫ ự ậ
Phương pháp chiết
- Chiết siêu âm: là phương pháp chiết có s dử ụng sóng siêu âm để rút ng n th i ắ ờ gian chiết và làm tăng hiệu su t chi t trong th i gian ng n. Chiấ ế ờ ắ ết siêu âm là phương pháp chi t có nhiế ều ưu điểm vượt tr i so với các phương pháp chiết khác như: ộ
35
+ Th i gian chi t xu t ng n: 30 60 phút/m . So vờ ế ấ ắ – ẻ ới phương pháp chiết ngâm thông thường có th mể ất đến 2-3 ngày.
+ Ti t kiế ệm được dung môi chiết do sóng siêu âm tăng khả năng hòa tan các chất trong dược li u, tệ ạo điều ki n thu n l i cho vi c chi t xu t và quá trình chi t triệ ậ ợ ệ ế ấ ế ệt để.
+ Nhiệt độ chi t xuế ất không làm thay đổi các ho t chạ ất trong dược li u. ệ 2.3. Các phương pháp phân lập h p ch t hợ ấ ữu cơ
Việc tách và phân l p các h p ch t t d ch chiậ ợ ấ ừ ị ết được th hi n b ng các k ự ệ ằ ỹ thuật sắc ký khác nhau như sắc ký c t (CC) và s c ký l p mỏộ ắ ớ ng (TCL). Trong phương pháp sắc ký, pha động là các lưu thể (các ch t tr ng thái khí hay lấ ở ạ ỏng) còn pha tĩnh là các chất trở ạng thái l ng hay r n. D a vào tr ng thái t p h p cỏ ắ ự ạ ậ ợ ủa pha động người ta chia s c ký thành hai nhóm: s c ký khí và s c ký l ng. Luắ ắ ắ ỏ ận văn này chúng tôi s d ng ử ụ phương pháp sắc ký lỏng, nghĩa là dùng chấ ỏng làm pha đột l ng. Trong s c ký l ng có ắ ỏ hai lo i c ạ ụthể như sau:
2.3.1. S c ký c t (CC)ắ ộ
Đây là phương pháp sắc ký ph bi n nh t, ch t h p ph ổ ế ấ ấ ấ ụ là pha tĩnh gồm các lo i ạ silica gel (có các kích thước khác hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion.
Silica gel pha thường có công th c hóa h c SiOứ ọ 2.xH2O đây chính là acid silixic, do đó silica gel có tính acid (pH = 3-5) nên hấp ph t t các ch t có tính base ụ ố ấ hơn là các h p ch t có tính ợ ấ acid. Sự ấ h p ph các ch t lên b m t các h t silica gel do s liên kết ụ ấ ề ặ ạ ự hidro gi a phân t các ch t nghiên c u và b m t các h t silica gel v i nhóm SiOH. ữ ử ấ ứ ề ặ ạ ớ N u liên k t hidro xu t hi n càng nhi u thì các phân t b ế ế ấ ệ ề ử ị giữ vào các ch t h p ph ấ ấ ụ càng mạnh. Đố ớ ắi v i s c ký cột pha thường, các ch t ít phân cấ ực ra trước còn các chất phân cực hơn ra sau.
Silica gel pha đảo ODS ho c YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.) ặ thường là silica gel được ankyl hóa, t o ra các gạ ốc ankyl mạch dài để tăng tính không phân cực
36
c a silica ủ gel. Đố ớ ộ ắc ký pha đải v i c t s o, các ch t phân cấ ực hơn ra trước còn ch t ít ấ phân cực ra sau (ngược với pha thường).
t h p ph
Chấ ấ ụ thường được nh i vào c t (ph bi n nh t hi n nay là c t th y tinh). ồ ộ ổ ế ấ ệ ộ ủ Độ ị m n c a ch t h p ph h t s c quan tr ng, nó ph n ánh s ủ ấ ấ ụ ế ứ ọ ả ố đĩa lý thuyết hay kh ả năng tách c a ch t h p phủ ấ ấ ụ. Độ ạ ủ h t c a ch t h p ph càng nh thì s ấ ấ ụ ỏ ố đĩa lý thuyết càng l n, ớ khả năng tách càng cao và ngượ ạc l i. Tuy nhiên n u ch t h p ph ế ấ ấ ụ có kích thước h t ạ nh thì tỏ ốc độ chảy càng gi m. Trong m t s ả ộ ố trường h p n u l c trợ ế ự ọng trường không đủ ớ l n s gây ra hiẽ ện tượng t c c t (dung môi không chắ ộ ảy được), khi đó người ta ph i ả s d ng áp su t v i áp su t trung bình (MPC), áp su t cao (HPLC). ử ụ ấ ớ ấ ấ
Trong s c ký, t l ắ ỉ ệ đường kính c t (D) so v i chi u cao c t (L) r t quan tr ng vì nó ộ ớ ề ộ ấ ọ thể ệ hi n kh ả năng tách của c t. T l L/D ph ộ ỷ ệ ụ thuộc vào yêu c u tách, t c là ph ầ ứ ụ thuộc vào h n h p ch t c ỗ ợ ấ ụthể mà ta có th ể chọn được c t phù h p. ộ ợ
T l ỉ ệgiữa quãng đường đi của ch t c n tách so vấ ầ ới quãng đường đi của dung môi là Rf, v i m i m t ch s có Rớ ỗ ộ ất ẽ f khác nhau. Nh s khác nhau v Rờ ự ề f này mà ta có th tách ể t ng ch t ra kh i h n h p. ừ ấ ỏ ỗ ợ
T l ỷ ệ chất so vớ ỷ ệi t l ch t h p ph ấ ấ ụ cũng rất quan tr ng và tùy thu c vào yêu c u ọ ộ ầ tách. N u tách thô thì t l này th p kho ng t 1/5- 1/10, còn n u tách tinh thì t lế ỉ ệ ấ ả ừ ế ỉ ệ này cao hơn và tùy thuộc vào h s tách (t c là ph ệ ố ứ ụ thuộc vào s khác nhau Rự f c a các ủ chất), thông thường t l này kho ng 1/20 - 1/30. ỉ ệ ả
Tùy thuộc vào lượng ch t và d ng chấ ạ ất mà người ta có th ể đưa chất lên c t b ng ộ ằ phương pháp khác nhau:
- Nếu lượng ch t nhi u và ch y thô, thì ph bi n là t m ch t v i sấ ề ạ ổ ế ẩ ấ ớ ilica gel r i làm ồ khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột.
- Nếu tách tinh, thì đưa trực ti p ch t lên c t b ng cách hòa tan ch t b ng dung ế ấ ộ ằ ấ ằ môi ch y c t vạ ộ ới lượng t i thi u. ố ể
37
Khi chu n b ẩ ị chạy c t ph i ộ ả lưu ý không để ọ b t khí bên trong (n u có b t khí gây ế ọ nên hiện tượng ch y r i trong c t và gi m hi u qu ạ ố ộ ả ệ ả tách).
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hi u qu tách. N u tệ ả ế ốc độ dòng chảy quá l n s làm gi m hi u qu tách. Còn n u tớ ẽ ả ệ ả ế ốc độchảy quá thấp thì s kéo dài ẽ thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công vi c. ệ
2.3.2. S c ký l p mắ ớ ỏng
S c ký l p m ng (TCLắ ớ ỏ ) thường đượ ử ụng để ểm tra và định hước s d ki ng cho s c ký ắ c t. S c ký l p m ng là m t k ộ ắ ớ ỏ ộ ỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di