Lá cây Phoebe poilanei (25 kg) được thu hái tại Tam Đường, Lào Cai, Vi t Nam ệ trong tháng 4 năm 2016. Tên khoa học được xác định là loài Phoebe poilanei Kosterm b i Tiở ến sĩ Bùi Văn Thanh, Vi n Sinh thái và Tài nguyên sinh v t, VAST. ệ ậ
Lá cây Phoebe poilanei sau khi thu hái v ề được r a sử ạch, phơi và sấy khô 40-ở 50oC. Khi m u khô thì xay nh thành bẫ ỏ ột thu được 3,2 kg b t lá ộ Phoebe poilanei.
43
3.2.2. T o c n chi t t ng và c n chiạ ặ ế ổ ặ ết phân đoạ ừ ộn t b t lá cây Phoebe poilanei
L y 3,2 kg b t lá cây ấ ộ Phoebe poilaneichiết siêu âm b ng dung môi MeOH (7 lít x 3 ằ l n) mầ ỗ ầi l n siêu âm trong 1 gi 40ờ ở oC b ng thi t b ằ ế ị chiết siêu âm Ultrasonic 410 sau đó lọ thu được c d ch chi t methanol. Các d ch chiị ế ị ết được gom l i l c và c t lo i dung ạ ọ ấ ạ môi dưới áp su t gi m nhiấ ả ở ệt độ 40-50oC thu được 280g c n chi t methanol C n ặ ế . ặ chiết
được phân b vào 2 lít ố nước c t ấ sau đó được chi t lế ần lượt với các dung môi dichloromethane (2 l n x 3 lít) ethyl acetate (2 l n x 3 lít) ầ và ầ thu đượ ần lượt các c l dịch chiết dichloromethane, d ch chi t EtOAc và dị ế ịch chiết nước.
Ba d ch chiị ết này được c t thu hấ ồi dung môi dưới áp su t giấ ảm ở nhiệt độ 40-50oC thu được c n chi t dichloromethane (ký hi u là D, 105,0g), c n chi t EtOAc (ký hi u là ặ ế ệ ặ ế ệ E, 52,0g) và c n ặ nước (ký hi u là W). Quy trình chi t lá ệ ế Phoebe poilanei được mô t ả trong sơ đồ 3.1.
44
B t lá cây ộ Phoebe poilanei
(3,2kg)
D ch chi t methanolị ế
1. Chi t v i methanol b ng b siêu âm Ultrasonic 410 ế ớ ằ ể (7 lít x 3 l n) m i l n 1 gi . ầ ỗ ầ ờ
2. Lọc.
C n chi t methanol ặ ế
(280g)
C t loấ ại dung môi dưới áp su t giấ ảm ở 40-50oC
1. Hòa tan trong 2 lít nước c t ấ
2. Chi t phân b lế ố ần lượ ớt v i các dung môi dichloromethane và ethyl acetate
D ch chiị ết Dichloromethane
Dịch chiết Ethyl
acetate D ch chi c
ị ết nướ
Sơ đồ 3.1: Sơ đồngâm chi t láế Phoebe poilanei
C Dichloromethane ặn (Ký hi u là D, 105,0g) ệ C n Ethyl acetate ặ (Ký ki u là E, 52,0g) ệ Cặn Nước (Ký hi u là W) ệ
C t loấ ại dung môi dưới áp su t giấ ảm ở 40-50oC C t loấ ại dung môi dưới
áp su t giấ ảm ở 40-50oC
C t loấ ại dung môi dưới áp su t giấ ảm ở 40-50oC
45
3.2.3. Phân l p các h p ch t t c n chi t dichloromethane ậ ợ ấ ừ ặ ế
C n chi dichloromethane (Ký hi u là D, 105,0 g) c a b t lá cây ặ ết ệ ủ ộ Phoebe poilanei được phân tách b ng s c ký c t v i ch t h p ph ằ ắ ộ ớ ấ ấ ụ pha thường silica gel, h dung môi ệ r a gi i là -hexane : acetone vử ả n ới độ phân c c cự ủa dung môi tăng dần (t 100:0, 40:1, ừ 10:1, 7:1, 5:1, 0:100, v/v). Các phân đoạn được cô quay dưới áp su t gi m ấ ả thu được 6 phân đoạn chính có khối lượng khác nhau là D1 (20,8g), D2 (12,7g), D3 (3,7g), D4 (3,3g), D5 (7,2g), D6 (13,8g).
Phân đoạn D4 (3,3g) được t m vào 7,0g silica ẩ gel, sau đó hòa tan một lượng h ệ dung môi -hexane: EtOAc (3:1, v/v) t i thin ố ểu, cô quay đuổi dung môi cho đến khi b t ộ tơi, khô. Tiến hành trên s c ký c t v i ch t h p ph ắ ộ ớ ấ ấ ụ silica gel pha thường, h dung môi ệ rửa giải n-hexane: EtOAc (3:1, v/v). Hứng các phân đoạn vào ng nghi m nh c ố ệ ỏ ỡ 20ml. Theo dõi quá trình r a gi i b ng s c ký l p mử ả ằ ắ ớ ỏng (TCL) pha thường và pha đảo v i các h dung môi thích h p. Các ng nghi m hi n v t gi ng nhau trên s c ký lớ ệ ợ ố ệ ệ ế ố ắ ớp m ng g p l i thànỏ ộ ạ h phân đoạ ớn, cô quay dung môi dướn l i áp su t giấ ảm thu được hai phân đoạn D4A (1,0g) và D4B (1,3g). Phân đoạn D4A (1,0g) ti p t c s c ký cế ụ ắ ột silica gel pha đảo YMC RP-18 v i h dung môi r a gi i là ớ ệ ử ả acetone: nước (5:1, v/v) thu được h p chợ ất PP1 (12,0mg).
Phân đoạn D5 (7,2g) được tiến hành s c ký c t ắ ộ silica gel pha đảoYMC RP-18 với h ệ dung môi methanol: nước (12:1, v/ v)thu được hai phân đoạn nh ỏ là D5A (1,5g) và D5B (3,8g). Phân đoạn D5A p ttiế ục được ti n hành trên s c ký c t ế ắ ộ pha đảo RP-18 với h dung môi r a gi i là ệ ử ả acetone: nước (5:1, v/v) thu được h p chợ ất PP2 (20,0mg) và h p chợ ất PP3 (15,0mg).
Phân đoạn D6 (13,8g) được ti n hành trên s c ký c t silica ế ắ ộ gel pha đảo RP-18 với h dung môi r a gi i là ệ ử ả methanol: nước (8:1, v/v) thu được hai phân đoạn nh D6A ỏ
(7,3g) và D6B (2,1g). Phân đoạn D6B (2,1g) tiếp t c ụ được r a gi i trên s c ký c t ử ả ắ ộ
46
silica gel pha đảo RP-18 với h dung môi acetone: ệ nước (3:1, v/v) thu được h p ch t ợ ấ PP4 (15,0mg).
Như vậy, t c n chi t dichloromethane c a b t lá cây ừ ặ ế ủ ộ Phoebe poilanei, đã phân lập được b n h p ch t tinh khi t. Quá trình phân l p c n chi t dichloromethane c a b t lá ố ợ ấ ế ậ ặ ế ủ ộ cây Phoebe poilaneiđược th hi n ể ệ ở sơ đồ 3.2.
47 C n chi dichloromethane ặ ết (Ký hi u là D, 105,0g) ệ D1 (20,8g) (12,7g) D2 (3,7g) D3 (3,3g) D4 (7,2g) D5 (13,8g) D6 - Silica gel C.C. - Gradient n-hexane:acetone (100:0 0:100, v/v) 100:0 40:1 10:1 7:1 5:1
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân l p các h p ch t PP1, PP2, PP3, PP4 ậ ợ ấ
t c n chi dichloromethane. ừ ặ ết 0:100 D4A (1,0g) D4B (1,3g) PP1 (12,0mg) D5A (1,5g) (3,8g) D5B PP2 (20,0mg) (15,0mg) PP3 D6A (7,3g) (2,1g) D6B PP4 (15,0mg) Silica gel C.C, n-hexane: EtOAc (3:1, v/v) YMC RP-18 C.C, acetone: nước (5:1, v/v) YMC RP-18 C.C , methanol: nước (12:1, v/v) YMC RP-18 C.C, acetone: nước (5:1, v/v) YMC RP-18 C.C, methanol: nước (8:1, v/v) YMC RP-18 C.C, acetone: nước (3:1, v/v)
48
3.2.4. Tính ch t v t lý và d u ph c a các h p ch t phân lấ ậ ữ liệ ổ ủ ợ ấ ập được
B ng ằ phương pháp sắc ký cột pha thường và pha đảo kế ợt h p v i s c ký b n m ng ớ ắ ả ỏ (TLC) đã phân lập được b n h p ch t ký hi u là: ố ợ ấ ệ PP1, PP2, PP3, PP4 t c n chiừ ặ ết dichloromethane c a b t lá cây ủ ộ Phoebe poilanei. Các h ng s vằ ố ật lý và d li u ph c a ữ ệ ổ ủ các h p ch t phân lợ ấ ập được như sau:
H p ch t PP1: Kaempferol ợ ấ
+ H p chợ ất thu được dướ ại d ng b t màu vàng nh t ộ ạ .
+ ESI-MS: m/z 287 [M+H]+; CTPT: C15H10O6 với M=286.
+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) và DEPT xem b ng ả 4.1, trang 56.
H p ch t PP2: Isoquercitrin ợ ấ
+ H p chợ ất thu được dướ ại d ng b t màu vàng cam. ộ
+ 1H-NMR 00 MHz, CD(4 3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem b ng 4.2, trang ả 62.
H p ch t PP3: Astragalin ợ ấ
+ H p chợ ất thu được dướ ại d ng b t màu vàng. ộ
+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem b ng 4.3, trang ả 68 .
H p ch t PP4: Myricitrin ợ ấ
+ H p chợ ất thu đượ dướ ại d ng b t màu vàng. ộ
+ ESI-MS: m/z 463 [M H]- -; CTPT: C21H20O12 với M = 464.
+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) và DEPT xem b ng ả 4.4, trang 74.
49
3.3. Ho t tính sinh h c c a các chạ ọ ủ ất tinh khi t phân l p t loài ế ậ ừ Phoebe poilanei
Hoạt tính gây độc tê bào in vitro của b n h p ch t tinh khi t ố ợ ấ ế (PP1, PP2, PP3, PP4) được th nghi m trên các dòng t ử ệ ế bào ung thư MCF-7, LU-1, Hep-G2 theo phương pháp như đã mô tả ở m c 2.5. Các th nghiụ ử ệm được ti n hành t i Phòng th nghi m ế ạ ử ệ sinh học Việ- n Công ngh sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh ệ ọ ệ ọ ệViệt Nam. K t qu ế ả được trình bày m c 4.3. ở ụ
50
CHƯƠNG 4: KẾT QU VÀ THẢ ẢO LUẬN
4.1. K t quế ả nghiên c u hóa h c lá cây ứ ọ Phoebe poilanei
T b t nguyên li u lá cây ừ ộ ệ Phoebe poilanei, chúng tôi đã nghiên cứu xây d ng quy ự trình chi t tách và tế ạo được d ch t ng methanol và các d ch chiị ổ ị ết phân đoạn v i các ớ dung môi có độ phân cực tăng dầ như: dichloromethane, EtOAc, nướn c (chi ti t xem ế tại sơ đồ 3.1, trang 44). Quy trình chi t này chúng tôi chi t b ng thi t b ế ế ằ ế ị chiết siêu âm Ultrasonic 410, cho phép chiết xuất dược li u mộệ t cách nhanh chóng, gần như là triệt để các ch t, ti t kiấ ế ệm được th i gian và dung môi chi t. ờ ế
T c n chi t dicholoromethane bừ ặ ế ằng phương pháp sắc ký c t silica ộ gel pha thường và pha đảo YMC RP-18 k t h p v i s c ký l p mế ợ ớ ắ ớ ỏng (TCL), chúng tôi đã phân lập được b n h p ch t ký hi u là: ố ợ ấ ệ PP1, PP2, PP3, PP4 (chi tiết xem tại sơ đồ 3.2, trang 47). C u trúc c a b n h p chấ ủ ố ợ ất này được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ khối lượng phun sương mù điệ ửn t ESI-MS, phổ ộng hưở c ng t h t nhân ừ ạ m t chi u (ộ ề 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), ph cổ ộng hưởng t h t nhân hai chi ừ ạ ều (HSQC) k t h p v i vi c so sánh trong các tài li u tham kh o. B n h p chế ợ ớ ệ ệ ả ố ợ ất này đều thuộc nhóm flavonoid đó là:
- Ba d n xu t flavonoid có khung là flavonol glycosidẫ ấ e: Isoquercitrin (PP2), Astragalin (PP3), Myricitrin (PP4)
51
4.2. Xác định c u trúc hóa h c c a các h p ch t phân lấ ọ ủ ợ ấ ập được
4.2.1. H p ch t PP1 ợ ấ (Kaempferol)
H p chợ ất PP1 phân lập được dướ ại d ng b t màu vàng nh t. ộ ạ
Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm) c a h p chủ ợ ất PP1 xu t hi n hai tín ấ ệ hi u ệ singlet tại 6,20 (1H, brs) và 6,40 (1H, brs) lần lượt đặc trưng cho tín hiệu c a hai ủ
proton vòng A t i v trí C-6 và C-8. Ngoài ra trên ph còn xu t hi n hai tín hiạ ị ổ ấ ệ ệu doublet của 4 proton thơm có hệ tương tác spin-spinAA’ XX’ ạ- t i 8,08 (2H, d, = 8,5 J Hz) và 6,92 (2H, d, = 8,5 Hz) J điều này ch ng t vòng B b ứ ỏ ị thế para. T d ừ ữ kiện ph ổ 1H-NMR trên cho phép d ự đoán PP1 là m flavonoid có c u trúc khung kaempferol. ột ấ
52
Hình 4.1. Ph ổ 1H-NMR c a hủ ợp ch t PP1 ấ
Phổ 13C-NMR và DEPT c a h p chủ ợ ất PP1 cho th y s xu t hi n tín hi u c a 15 ấ ự ấ ệ ệ ủ nguyên t cacbon, bao g m: 9 cacbon bử ồ ậc 4 (C) và 6 cacbon metin (CH) trong đó hai c p tín hi u nhóm metin t i ặ ệ ạ δC (ppm) = 130,7 và δC (ppm) = 116,3 đều thể ệ hi n tín hiệu của 2 nhóm CH đố ứng nhau và đặc trưng cho vòng B củi x a kaempferol. Ngoài ra còn có 1 nhóm carbonyl ở δC (ppm) = 177,3 (C=O). T nh ng d ừ ữ ữkiện ph trên, cùng s so ổ ự sánh v i h p ch kaempferol [5] nêu ra trong b ng 4.1ớ ợ ất ả , hợp chất PP1 được xác định là kaempferol. Kaempferol là m t flavonoid t nhiên ộ ự được tìm th y trong các lo i trái ấ ạ cây, rau qu (nho, dâu tây, cà chua, trà, c i xanh, rau di p) và trong m t s ả ả ế ộ ố thảo dược được s d ng trong y h c c ử ụ ọ ổ truyền như: Bạch qu có tên khoa h c là ả ọ Ginkgo biloba, thuộc h b ch qu ọ ạ ả (Ginkgoaceae), đoạn lá b c có tên khoa h c là ạ ọ Tillia tometosa, chùm ngây có tên khoa h c là ọ Moringa oleifera, vv [14]. Trên th ếgiới, ho t tính c a h p chạ ủ ợ ất kaemferol đã được các nhà khoa h c nghiên c u r t nhi u. Nghiên c u d ch t họ ứ ấ ề ứ ị ễ ọc đã chỉ ra r ng vi c tiêu th nhi u th c ph m có ch a kaempferol có th ằ ệ ụ ề ự ẩ ứ ểgiảm nguy cơ phát
53
triển m t s ộ ốloại ung thư (ung thư phổi, d dày, tuy n t y, bu ng tr ng) và các bệnh v ạ ế ụ ồ ứ ề tim mạch.
M t s nghiên c u ộ ố ứ đã chỉ ra s có m t c a m t liên kự ặ ủ ộ ết đôi ở ị v trí C-2, C-3 cùng
v i s k t h p c a m t nhóm carbonyl v trí C-4 và s hi n di n c a các nhóm ớ ự ế ợ ủ ộ ở ị ự ệ ệ ủ hydroxyl C-3, C-5, C-7, C-ở 4’ là những đặc tính quan trọng liên quan đến ho t tính ạ chống oxy hóa c a kaempferol. ủ Kaempferol đã được tìm th y có ho t tính ấ ạ chống oxy hóa mạnh v i vi c b t ớ ệ ắ các gố ực t do superoxide aninon (O2-) có giá tr ị IC50 = 0,5 µM, hydroxyl (OH-) với tác nhân Fenton có giá tr ICị 50 = 0,5 µM và peroxynitrite (ONOO-) có giá tr ị IC50 = 0,35 ± 0,5 µM. M t vài nghiên c u ộ ứ in vivo chỉ ra r ng d ch chi t t ằ ị ế ừ loài Ginkgo biloba có ch a d n xuứ ẫ ất kaempferol và quercetin cũng cho thấy có tác d ng ch ng oxy hóa ụ ố .
Giống như các flavonoid khác kaempferol có đặc tính ch ng viêm, r t nhi u báo ố ấ ề cáo ch ra r ng kaempferol có ho t tính ch ng viêm không ch ỉ ằ ạ ố ỉ in vitro mà còn in vivo.
M t s báo cáo ch ra r ng kaempferol có th c ch m t s emzymộ ố ỉ ằ ể ứ ế ộ ố e như cyclooxygenases 2 (COX-2), lipoxygenase (LOX) chúng là nh ng tác nhân quan tr ng ữ ọ trong quá trình viêm b ng cách tham gia t ng h p eicosanoids (ví d : prostaglandin, ằ ổ ợ ụ leukotrien).
Ngoài ra, nhi u nghiên c u tiề ứ ền lâm sàng đã chỉ ra r ng kaempferol còn có m t s ằ ộ ố
đặc tính dược lý khác bao g m ho t tính kháng khu n, ch ng ung ồ ạ ẩ ố thư, b o v tim ả ệ
m ch, ạ chống tiểu đường, chống loãng xương, giảm âu lo, giảm đau, chống d ng ị ứ [14, 39 ].
54
Hình 4.2. Ph DEPT c a h p ch t PP1 ổ ủ ợ ấ
Hình 4.3. Ph ổ13C-NMR c a hủ ợp ch t PP1 ấ
55
Kết quả phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất PP1xuất hiện các píc ion giả phân tử tại m/z 287,14 [M+H]+ cũng hoàn toàn phù hợp với công thức phân tử C15H10O6 (M = 286,23) của kaempferol.
56
B ng 4.1. D u ph NMR c a hả ữ liệ ổ ủ ợp chất PP1 và h p chợ ất tham kh o ả
V trí C ị 1,aδC a,bδC a,b)DEPT a,c)δH(độ ộ b i, = Hz) J
2 148,1 148,1 C - 3 137,1 137,1 C - 4 177,4 177,3 C - 5 162,5 162,4 C - 6 99,3 99,3 CH 6,20 (brs) 7 165,6 165,5 C - 8 94,5 94,5 CH 6,40 (brs) 9 158,3 158,2 C - 10 104,6 104,5 C - 1’ 123,7 123,7 C - 2’, 6’ 130,7 130,7 CH 8,08 (d, 8,5) 3’, 5’ 116,3 116,3 CH 6,92 (d, 8,5) 4’ 160,5 160,5 C -
Ghi chú: a) đo trong CD3OD, b) 125 MHz, c) 500 MHz, 1δC c a kaempferol [5 ủ ].
Hình 4.5. Công thức c u t o c a hấ ạ ủ ợp ch PP1 ất
4.2.2. H p ch t PP2 (Isoquercitrin) ợ ấ
H p chợ ất PP2 phân lập được dướ ại d ng b t màu vàng cam. ộ
Trên ph ổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δH (ppm) c a h p chủ ợ ất PP2 xu t hi n ấ ệ tín hi u cệ ủa 5 proton vòng thơm trong đó hai tín hi u singlet t i 6,19 (1H,brs) và 6,38 (1H, ệ ạ brs) lần lượt đặc trưng cho tín hiệu c a hai proton H-6 và H-8 củ ủa vòng thơm A có hai
57
nhóm th v ế ở ị trí meta với nhau và 3 tín hi u proton còn lệ ại được xác định thu c vào ộ vòng thơm B có h ệ tương tác spin ABX 85 (1H, d, = 8,0 ở [6, J Hz), 7,56 (1H, d, J = 7,6 Hz), 7,69 (1H, brs)]. Điều này ch ng t ứ ỏ vòng thơm B có nhóm thế ở ị v trí C-3’ và C-4’. Ngoài ra, trên ph ổ 1H-NMR còn xu t hi n s có m t các proton c a m t phân t ấ ệ ự ặ ủ ộ ử đường trong vùng 3,20 - 5,22 ppm, bao g m 1 proton anomer 5,22 (1H, d, = 7,ồ ở J 2 Hz), b n tín proton methin cố ủa đường tại H 3,45 (1H), 3,40 (1H), 3,34 (1H), 3,20 (1H, m) và tín hi u 2 proton methylen tệ ại H 3,56 (1H, dd, = 5,6 và 11,6 Hz) và 3,69 (1H, J brd, = 11,6Hz) cho th y có s xu t hi n c a mJ ấ ự ấ ệ ủ ột phân t ử đường -D-glucose.
Hình 4.6. Ph ổ 1H-NMR c a hủ ợp ch t PP2 ấ
Phổ 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) c a h p chủ ợ ất PP2 xu t hi n tín hi u c a 21 ấ ệ ệ ủ
cacbon, trong đó có 15 cacbon thuộc khung quercetin (bảng 4.2) với tín hi u nhóm ệ carbonyl xu t hi n tấ ệ ại C 179,5 (C=O), sáu cacbon còn l i cạ ủa đường glucopyranoside tại C (ppm):104,2, 75,7, 78,1, 71,2, 78,4 và 62,5. Ngoài ra, các giá tr cị ộng hưởng của proton liên k t tr c ti p vế ự ế ới cacbon được xác định chính xác nh vào k ờ ỹ thuật ph ổ 2
58
chiều HSQC. C th , trong ph này, các proton ụ ể ổ ở δH 6,19, 6,38, 7,69, 6,85, 7,56 có tương quan trực ti p v i các nguyên t cacbon lế ớ ử ần lượ ở δt C 99,9, 94,7, 116,0, 117,5,