Nguyên t c cắ ủa phương pháp phổ MS là d a vào s phân m nh ion c a phân t ự ự ả ủ ử chấ ầt c n nghiên cứu dướ ự ắi s b n phá c a m t chùm ion t bên ngoài. Ph MS cho các ủ ộ ừ ổ
38
pic ion m nh khác mà dả ựa vào đó người ta có th ể xác định được cơ chế phân m nh và ả d ng lự ại được c u trúc hóa h c các h p ch t. ấ ọ ợ ấ Phổ khối lượng được s d ng trong luử ụ ận văn này là ESI-MS.
- PhổESI-MS (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) g i là ph phun mù ọ ổ điện t . Ph ử ổ này được th c hi n vự ệ ới năng lượng b n phá thắ ấp hơn nhiều so với ph ổ EI-MS, do đó phổ thu được ch y u là các pic ion phân t ủ ế ử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên k t có mế ức năng lượng th p, d b phá v . Vì th thưấ ễ ị ỡ ế ờng ng dứ ụng để xác định khối lượng phân t ch t nghiên c u. ử ấ ứ
2.4.2. Phổ ộng hưở c ng t h t nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, ừ ạ
NMR)
Phổ ộng hưở c ng t h t nhân là mử ạ ột phương pháp phổ ện đạ hi i và h u hi u nh t hi n ữ ệ ấ ệ nay. V i vi c s d ng k t h p các k ớ ệ ử ụ ế ợ ỹ thuật ph NMR mổ ột chi u và hai chi u, các nhà ề ề nghiên c u có th ứ ể xác định chính xác c u trúc c a h p ch t, kấ ủ ợ ấ ể ả ấ c c u trúc l p th c a ậ ể ủ phân t . ử
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR (ph proton và cacbon) là s c ng ổ ự ộ hưởng khác nhau c a các h t nhân t (ủ ạ ừ 1H và 13C) dưới tác d ng c a t ụ ủ ừ trường ngoài. S ự cộng hưởng khác nhau này được bi u di n bể ễ ằng độ chuy n d ch hóa hể ị ọc. Ngoài ra, đặc trưng của phân t ử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các h t nhân v i ạ ớ nhau.
- Phổ 1H-NMR: trong ph ổ1H- NMR, độchuyển d ch hóa hị ọc (δ) của proton được xác định trong thang ppm t 0-14ppm, tùy thu c vào mừ ộ ức độ lai hóa c a nguyên t ủ ử cũng như đặc trưng riêng ủ ừc a t ng ph n. D a vào nhầ ự ững đặc trưng của độ chuy n d ch ể ị hóa học và tương tác spin mà ta có thể xác định được c u trúc hóa h c c a h p ch ấ ọ ủ ợ ất.
- Phổ 13C-NMR: ph này cho tín hi u v ch ph cacbon. M i nguyên t cacbon s ổ ệ ạ ổ ỗ ử ẽ cộng hưởng mở ột trường khác nhau và cho tín hi u ph ệ ổ khác nhau. Thang đo của phổ
39
13C-NMR là ppm, v i dớ ải thang đo rộng 0 233ppm. T n s – ầ ố đo 13C-NMR (100 MHz ho c 125 MHz). ặ
- Phổ DEPT (Distrortionless Enhancement by Polarisation Transfer): Ph này ổ cho ta các tín hi u phân lo i các lo i cacbon khác nhau. Trên ph DEPT, tín hi u cệ ạ ạ ổ ệ ủa các cacbon b c b n bi n mậ ố ế ất. Tín hi u c a CH và CHệ ủ 3 n m v m t phía và CHằ ề ộ 2 v mề ột phía trên ph DEPT 135ổ o. Trên ph DEPT 90ổ o chỉ xu t hi n tín hi u ph c a các CH. ấ ệ ệ ổ ủ
- Phổ 2D-NMR: Đây là kỹ thuật ph hai chi u, cho phép ổ ề xác định các tương tác c a các h t nhân trong không gian hai chi u. K ủ ạ ề ỹthuật đượ ử ục s d ng trong luận văn này là:
Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp m t n i gi H-ộ ố ữ C được xác định nh ờ vào tương tác trên phổ này. Trên ph , mổ ột tr c là ụ ph ổ 1H-NMR, còn tr c kia là ụ 13C-NMR. Các tương tác nằm trên đỉnh các ô vuông trên ph . ổ
2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh h c ọ
2.5.1. V t li u ậ ệ
- Hoá ch tấ : Các hóa ch t c n thi t khác c a các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen ấ ầ ế ủ bao gồm: L-glutamine, sodium bicarbonate, glucose, HEPES (4- -hydroxyethyl)-1-(2 piperazineethanesulfonic acid), sodium pyruvate, fetal bovine serum (FBS), DMSO 10%, mu i tetrazolium. ố
- M u thẫ ử: Các h p ch t tinh khiợ ấ ết đượ phân lập t ừloài Phoebe poilanei.
- Các dòng t ế bào ung thư: MCF-7 (ung thư vú), LU 1 (ung thư phổ- i), Hep-G2
(ung thư gan) do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại h c Hawaii và GS. Jeanette ọ Maier, trường Đạ ọi h c Milan (Italia) cung c p. ấ
40
2.5.2. Phương pháp nuôi cấ ếy t bào in vitro
Các dòng t ế bào ung thư được nuôi cấy dướ ạng đơn lớp trong môi trười d ng nuôi
c y DMEM vấ ới thành ph n kèm theo gầ ồm 2 mM -glutamine, 1,5 g/L sodium L
bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra b ổ sung 10% huy t thanh phôi bò (FBS). T ế ế bào được c y chuy n sau 3 ngày v i t l ấ ể ớ ỉ ệ (1:3) và nuôi trong t m COủ ấ 2 ở điều ki n 37ệ oC, 5% CO2.
2.5.3. Phương pháp thử tác dụng gây độc tê bào ung thư
Phương pháp thử độ độ c t bào ế in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa K ỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nh n là phép th c t bào chu n nh m sàng ậ ử độ độ ế ẩ ằ l c, phát hi n các ch t có kh ọ ệ ấ ả năng gây độ ếc t bào ở điều ki n ệ in vitro. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí Immunological Methods năm 1983[33]. Tác giả sử ụng muối tetrazolium (MTT (3 d -(4,5-dimethylthiazol-2-yl )- 2,5-diphenyltetrazolium bromide)) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá
về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào. Nguyên lý c a phép th là vòng ủ ử tetrazolium của thu c thố ử bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzyme dehydrogenase trong tế bào, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím formazan. K t qu ế ả đọc trên máy quang ph ổ và có độ chính xác cao. Phép th ử được th c ự hiện trong điều ki n c ệ ụthể như sau:
- Chất thử (20 L) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ 100 g/mL, 20 g/mL, 4 g/mL và 0,8 g/mL.
- Sau khi điều chỉnh để có mật độ tế bào phù hợp, hút 180 L tế bào vào các giếng c a khay 96 giếng đã có chất thử. Trên cùng một đĩa thử, bố trí một số giếng để ủ làm đối ch ng không có m u th , ch có dung môi pha m u là DMSO 10%. ứ ẫ ử ỉ ẫ
- Để đĩa nuôi cấy vào trong tủ ấm CO2 ở điều ki n 37ệ oC, 5% CO2, nuôi trong thời gian 72 giờ.
41
- Sau 72 giờ, 10µL MTT (nồng độ cuối cùng là 5mg/mL) được cho vào mỗi giếng.
- Sau 4h, loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 50µL DMSO 100 %.
- Giá trị mật độ quang h c (OD-ọ Optical Density) đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ.
- Lượng t bào s ng sót s ế ố ẽ được tính theo công thức:
OD (ch t th ấ ử) – OD ( i ch ng tr ng) đố ứ ắ % T bào s ng sótế ố =
OD (DMSO ) – OD ( i ch ng tr ng) đố ứ ắ % T bào b c chế ị ứ ế= 100% - % T bào s ng sótế ố
- Các phép th ử đượ ặ ạc l p l i 3 lần để đả m b o tính chính xác. Ellipticine (Sigma) ả luôn được s dử ụng như là chất đối chứng dương và được th nghi m các nử ệ ở ồng độ 10, 2, 0,4 và 0,08 µg/mL.
- DMSO 10% luôn được s dử ụng như đối ch ng âm. Giá tr ứ ị IC50(nồng độ ứ c ch ế 50% s phát tri n) s ự ể ẽ được xác định nh vào ph n m m máy tính TableCurve 2Dv4. ờ ầ ề
- Theo tiêu chu n c a Vi n ung ẩ ủ ệ thư quốc gia Hoa K (NCI), c n chiỳ ặ ết được coi có ho t tính t t v i ICạ ố ớ 50 20 g/ml, trong khi ch t tinh khiμ ấ ết được coi có ho t tính tạ ốt (hit compound) khi IC50 5 M [25 μ ].
42
CHƯƠNG 3: THỰC NGHI M Ệ
3.1. Thi bết ị và hóa ch t ấ
3.1.1. Thi t b ế ị xác định cấu trúc
+ Phổ ộng hưở c ng t h t nhân m t chi u ừ ạ ộ ề (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) và hai chi u (HSQC) ề được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrorneter c a Vi n Hóa h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh ủ ệ ọ ệ ọ ệ Việt Nam và máy Burker 400 MHz, Hàn Quốc. V i dung môi CDớ 3OD, ch t n i chu n là ấ ộ ẩ tetrametylsilan (™S).
+ Phổ khối lượng phun mù điện t ử (Electron Spray Ionization Mass Spectra) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap c a Vi n Hóa h c, Vi n Hàn lâm Khoa ủ ệ ọ ệ h c và Công ngh ọ ệ Việt Nam.
3.1.2. Hóa ch t ấ
+ Silica gel 60 (0,04-0,063 mm) Merck.
+ Silica gel pha đảo ODS ho c YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.). ặ
+ S c ký b n m ng (TCL) tráng s n ắ ả ỏ ẵ silica gel pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) và pha đảo RP-18 F254S(Merck).
+ Các lo i dung môi hạ ữu cơ như methanol, ethanol et, hyl acetate, chloroform, n-hexane, acetone,...
3.2. Nghiên c u thành ph n hóa h c lá c a loài ứ ầ ọ ủ Phoebe poilanei 3.2.1. X lý mử ẫu 3.2.1. X lý mử ẫu
Lá cây Phoebe poilanei (25 kg) được thu hái tại Tam Đường, Lào Cai, Vi t Nam ệ trong tháng 4 năm 2016. Tên khoa học được xác định là loài Phoebe poilanei Kosterm b i Tiở ến sĩ Bùi Văn Thanh, Vi n Sinh thái và Tài nguyên sinh v t, VAST. ệ ậ
Lá cây Phoebe poilanei sau khi thu hái v ề được r a sử ạch, phơi và sấy khô 40-ở 50oC. Khi m u khô thì xay nh thành bẫ ỏ ột thu được 3,2 kg b t lá ộ Phoebe poilanei.
43
3.2.2. T o c n chi t t ng và c n chiạ ặ ế ổ ặ ết phân đoạ ừ ộn t b t lá cây Phoebe poilanei
L y 3,2 kg b t lá cây ấ ộ Phoebe poilaneichiết siêu âm b ng dung môi MeOH (7 lít x 3 ằ l n) mầ ỗ ầi l n siêu âm trong 1 gi 40ờ ở oC b ng thi t b ằ ế ị chiết siêu âm Ultrasonic 410 sau đó lọ thu được c d ch chi t methanol. Các d ch chiị ế ị ết được gom l i l c và c t lo i dung ạ ọ ấ ạ môi dưới áp su t gi m nhiấ ả ở ệt độ 40-50oC thu được 280g c n chi t methanol C n ặ ế . ặ chiết
được phân b vào 2 lít ố nước c t ấ sau đó được chi t lế ần lượt với các dung môi dichloromethane (2 l n x 3 lít) ethyl acetate (2 l n x 3 lít) ầ và ầ thu đượ ần lượt các c l dịch chiết dichloromethane, d ch chi t EtOAc và dị ế ịch chiết nước.
Ba d ch chiị ết này được c t thu hấ ồi dung môi dưới áp su t giấ ảm ở nhiệt độ 40-50oC thu được c n chi t dichloromethane (ký hi u là D, 105,0g), c n chi t EtOAc (ký hi u là ặ ế ệ ặ ế ệ E, 52,0g) và c n ặ nước (ký hi u là W). Quy trình chi t lá ệ ế Phoebe poilanei được mô t ả trong sơ đồ 3.1.
44
B t lá cây ộ Phoebe poilanei
(3,2kg)
D ch chi t methanolị ế
1. Chi t v i methanol b ng b siêu âm Ultrasonic 410 ế ớ ằ ể (7 lít x 3 l n) m i l n 1 gi . ầ ỗ ầ ờ
2. Lọc.
C n chi t methanol ặ ế
(280g)
C t loấ ại dung môi dưới áp su t giấ ảm ở 40-50oC
1. Hòa tan trong 2 lít nước c t ấ
2. Chi t phân b lế ố ần lượ ớt v i các dung môi dichloromethane và ethyl acetate
D ch chiị ết Dichloromethane
Dịch chiết Ethyl
acetate D ch chi c
ị ết nướ
Sơ đồ 3.1: Sơ đồngâm chi t láế Phoebe poilanei
C Dichloromethane ặn (Ký hi u là D, 105,0g) ệ C n Ethyl acetate ặ (Ký ki u là E, 52,0g) ệ Cặn Nước (Ký hi u là W) ệ
C t loấ ại dung môi dưới áp su t giấ ảm ở 40-50oC C t loấ ại dung môi dưới
áp su t giấ ảm ở 40-50oC
C t loấ ại dung môi dưới áp su t giấ ảm ở 40-50oC
45
3.2.3. Phân l p các h p ch t t c n chi t dichloromethane ậ ợ ấ ừ ặ ế
C n chi dichloromethane (Ký hi u là D, 105,0 g) c a b t lá cây ặ ết ệ ủ ộ Phoebe poilanei được phân tách b ng s c ký c t v i ch t h p ph ằ ắ ộ ớ ấ ấ ụ pha thường silica gel, h dung môi ệ r a gi i là -hexane : acetone vử ả n ới độ phân c c cự ủa dung môi tăng dần (t 100:0, 40:1, ừ 10:1, 7:1, 5:1, 0:100, v/v). Các phân đoạn được cô quay dưới áp su t gi m ấ ả thu được 6 phân đoạn chính có khối lượng khác nhau là D1 (20,8g), D2 (12,7g), D3 (3,7g), D4 (3,3g), D5 (7,2g), D6 (13,8g).
Phân đoạn D4 (3,3g) được t m vào 7,0g silica ẩ gel, sau đó hòa tan một lượng h ệ dung môi -hexane: EtOAc (3:1, v/v) t i thin ố ểu, cô quay đuổi dung môi cho đến khi b t ộ tơi, khô. Tiến hành trên s c ký c t v i ch t h p ph ắ ộ ớ ấ ấ ụ silica gel pha thường, h dung môi ệ rửa giải n-hexane: EtOAc (3:1, v/v). Hứng các phân đoạn vào ng nghi m nh c ố ệ ỏ ỡ 20ml. Theo dõi quá trình r a gi i b ng s c ký l p mử ả ằ ắ ớ ỏng (TCL) pha thường và pha đảo v i các h dung môi thích h p. Các ng nghi m hi n v t gi ng nhau trên s c ký lớ ệ ợ ố ệ ệ ế ố ắ ớp m ng g p l i thànỏ ộ ạ h phân đoạ ớn, cô quay dung môi dướn l i áp su t giấ ảm thu được hai phân đoạn D4A (1,0g) và D4B (1,3g). Phân đoạn D4A (1,0g) ti p t c s c ký cế ụ ắ ột silica gel pha đảo YMC RP-18 v i h dung môi r a gi i là ớ ệ ử ả acetone: nước (5:1, v/v) thu được h p chợ ất PP1 (12,0mg).
Phân đoạn D5 (7,2g) được tiến hành s c ký c t ắ ộ silica gel pha đảoYMC RP-18 với h ệ dung môi methanol: nước (12:1, v/ v)thu được hai phân đoạn nh ỏ là D5A (1,5g) và D5B (3,8g). Phân đoạn D5A p ttiế ục được ti n hành trên s c ký c t ế ắ ộ pha đảo RP-18 với h dung môi r a gi i là ệ ử ả acetone: nước (5:1, v/v) thu được h p chợ ất PP2 (20,0mg) và h p chợ ất PP3 (15,0mg).
Phân đoạn D6 (13,8g) được ti n hành trên s c ký c t silica ế ắ ộ gel pha đảo RP-18 với h dung môi r a gi i là ệ ử ả methanol: nước (8:1, v/v) thu được hai phân đoạn nh D6A ỏ
(7,3g) và D6B (2,1g). Phân đoạn D6B (2,1g) tiếp t c ụ được r a gi i trên s c ký c t ử ả ắ ộ
46
silica gel pha đảo RP-18 với h dung môi acetone: ệ nước (3:1, v/v) thu được h p ch t ợ ấ PP4 (15,0mg).
Như vậy, t c n chi t dichloromethane c a b t lá cây ừ ặ ế ủ ộ Phoebe poilanei, đã phân lập được b n h p ch t tinh khi t. Quá trình phân l p c n chi t dichloromethane c a b t lá ố ợ ấ ế ậ ặ ế ủ ộ cây Phoebe poilaneiđược th hi n ể ệ ở sơ đồ 3.2.
47 C n chi dichloromethane ặ ết (Ký hi u là D, 105,0g) ệ D1 (20,8g) (12,7g) D2 (3,7g) D3 (3,3g) D4 (7,2g) D5 (13,8g) D6 - Silica gel C.C. - Gradient n-hexane:acetone (100:0 0:100, v/v) 100:0 40:1 10:1 7:1 5:1
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân l p các h p ch t PP1, PP2, PP3, PP4 ậ ợ ấ
t c n chi dichloromethane. ừ ặ ết 0:100 D4A (1,0g) D4B (1,3g) PP1 (12,0mg) D5A (1,5g) (3,8g) D5B PP2 (20,0mg) (15,0mg) PP3 D6A (7,3g) (2,1g) D6B PP4 (15,0mg) Silica gel C.C, n-hexane: EtOAc (3:1, v/v) YMC RP-18 C.C, acetone: nước (5:1, v/v) YMC RP-18 C.C , methanol: nước (12:1, v/v) YMC RP-18 C.C, acetone: nước (5:1, v/v) YMC RP-18 C.C, methanol: nước (8:1, v/v) YMC RP-18 C.C, acetone: nước (3:1, v/v)
48
3.2.4. Tính ch t v t lý và d u ph c a các h p ch t phân lấ ậ ữ liệ ổ ủ ợ ấ ập được
B ng ằ phương pháp sắc ký cột pha thường và pha đảo kế ợt h p v i s c ký b n m ng ớ ắ ả ỏ (TLC) đã phân lập được b n h p ch t ký hi u là: ố ợ ấ ệ PP1, PP2, PP3, PP4 t c n chiừ ặ ết dichloromethane c a b t lá cây ủ ộ Phoebe poilanei. Các h ng s vằ ố ật lý và d li u ph c a ữ ệ ổ ủ các h p ch t phân lợ ấ ập được như sau:
H p ch t PP1: Kaempferol ợ ấ
+ H p chợ ất thu được dướ ại d ng b t màu vàng nh t ộ ạ .
+ ESI-MS: m/z 287 [M+H]+; CTPT: C15H10O6 với M=286.
+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) và DEPT xem b ng ả 4.1, trang 56.
H p ch t PP2: Isoquercitrin ợ ấ
+ H p chợ ất thu được dướ ại d ng b t màu vàng cam. ộ
+ 1H-NMR 00 MHz, CD(4 3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem b ng 4.2, trang ả 62.
H p ch t PP3: Astragalin ợ ấ
+ H p chợ ất thu được dướ ại d ng b t màu vàng. ộ
+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) xem b ng 4.3, trang ả 68 .
H p ch t PP4: Myricitrin ợ ấ
+ H p chợ ất thu đượ dướ ại d ng b t màu vàng. ộ
+ ESI-MS: m/z 463 [M H]- -; CTPT: C21H20O12 với M = 464.
+ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) và DEPT xem b ng ả 4.4, trang 74.
49
3.3. Ho t tính sinh h c c a các chạ ọ ủ ất tinh khi t phân l p t loài ế ậ ừ Phoebe poilanei
Hoạt tính gây độc tê bào in vitro của b n h p ch t tinh khi t ố ợ ấ ế (PP1, PP2, PP3, PP4) được th nghi m trên các dòng t ử ệ ế bào ung thư MCF-7, LU-1, Hep-G2 theo phương pháp như đã mô tả ở m c 2.5. Các th nghiụ ử ệm được ti n hành t i Phòng th nghi m ế ạ ử ệ sinh học Việ- n Công ngh sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh ệ ọ ệ ọ ệViệt Nam.