Butler và Flynn phát hiện Cystatin C lần đầu tiên năm 1961, khi điện di protein nước tiểu của bệnh nhân thấy dấu hiệu của một protein mới đi theo sau γ protein trên băng giấy ghi kết quả điện di, protein mới xuất hiện ở 79% bệnh nhân có tổn thương ống thận và trên cả điện di 2 chiều [50]. Đến năm 1982, công thức hóa học của cystatin C được mô tả đầy đủ, chức năng của nó cũng dần được sáng tỏ [42],[80],[102].
Cystatin C là một chất ức chế enzym cysteine proteinase có trọng lượng phân tử thấp (13.350 daltons), là một enzym phân cắt polypeptid rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa của các tế bào có nhân. Cystatin C do các tế bào có nhân trong cơ thể sản xuất với mức độ hằng định, được lọc tự do qua cầu thận, tái hấp thu và chuyển hóa hoàn toàn ở ống lượn gần, nên nồng độ cystatin C trong huyết thanh là chất nội sinh được dùng để xác định chức năng lọc cầu thận [50],[63] [80], [102].
Kỹ thuật tự động hiện đại trong phòng xét nghiệm đã được dùng để đo cystatin C huyết thanh (Serum cystatin C: ScysC) chính xác, nhanh chóng và có thể dùng trong thực hành thường qui. Các giá trị ScysC đã được xác định ở người lớn và trẻ em trên một tuổi, cho thấy không có sự khác biệt về giới tính, tuổi tác trong cùng một phương pháp đo với các điều kiện đã được chuẩn hóa. Trong các nghiên cứu gần đây về các loại bệnh thận ở người lớn và trẻ em đã cho thấy ScysC là một chất xác định GFR tốt hơn creatinin huyết thanh [43],[47],[50],[54],[80],[102].
Trong thực hành lâm sàng, mặc dù creatinin huyết thanh đo dễ dàng và rẻ tiền. Nhưng nồng độ creatinin huyết thanh bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như kỹ thuật đo, chuyển hóa creatinin. Ngoài ra, ĐTLcre 24 giờ tùy vào việc thu thập nước tiểu theo thời gian, việc tuân thủ của bệnh nhân khi làm xét nghiệm[80], [102]. Do đó, với đà phát triển hiện nay trong điều trị, dự phòng và theo dõi bệnh, cần phải có một phương pháp xác định GFR nhanh, chính xác, đơn giản hơn. Cystatin C, một protein có trọng lượng phân tử thấp hội đủ hầu hết các
tiêu chuẩn trên, là một chất nội sinh lý tưởng để đo GFR. Trong những năm gần đây phương pháp này đã phát triển khá phổ biến trong thực hành lâm sàng ở nhiều nước trên thế giới.
Hình 1.2: Cấu trúc phân tử cystatin C lần lượt bậc 1, 2, 3, 4
“Nguồn: Kolodziejczyk, 2010” [63]
1.3.1 Đặc tính của cystatin C
Năm 1961, Clausen đã tìm thấy trong dịch não tủy bình thường có một loại protein có tính kiềm là γ-CSF, và Post-γ-protein trong nước tiểu của bệnh nhân tiểu đạm do ống thận. Năm 1962, người ta dùng điện di, tìm thấy một protein nữa
là γ-trace có trong dịch não tủy, máu, nước tiểu, dịch màng bụng, dịch màng phổi. γ-trace cũng được gọi là Post-γ globulin. Năm 1984, người ta phát hiện thêm một cystein ức chế enzym proteinase mới từ huyết thanh giống hệt γ-trace ở người. Cystatin ở người được gọi là cystatin C, tương tự như ở lòng trắng trứng và cystatin A, B ở động vật có vú [43],[47],[50],[54],[63],[80],[102].
Cystatin C là một loại protein có 120 acid amin, không thủy phân, trọng lượng phân tử 13.350 daltons và có điểm đẳng điện là 9,3. Toàn bộ trình tự nucleotid của gen đã được xác định và gen đó ở nhiễm sắc thể số 20. Cấu trúc gen giống với loại gen giữ nhà (housekeeping), được sản xuất với mức độ hằng định ở hầu hết tất cả các tế bào có nhân. Cấu trúc của gen này bao gồm 3 đoạn exon xen kẽ 2 đoạn intron. Cystatin C được giải phóng từ các tế bào có nhân sẽ được lọc tự do qua cầu thận và được tái hấp thu và chuyển hóa tại ống thận. Các nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng hơn 99% cystatin C được hấp thu và chuyển hóa tại ống thận. Tại đây, cystatin C được tái hấp thu bằng cách gắn vào phân tử megalin ở bề mặt vi nhung mao ống thận, megalin là glycoprotein thuộc nhóm các thụ cảm thể gắn với lipoprotein trọng lượng phân tử thấp tham gia chuyển hóa protein xuất hiện ở lòng ống thận, trong đó có cystatin C [43],[47],[50],[54],[63],[80],[102].
Chức năng của cystatin C: điều hòa hoạt động của cystein protease, cụ thể là ức chế enzym này trong một số quá trình sinh học của cơ thể. Vì có trọng lượng phân tử thấp và điện tích dương trong môi trường pH sinh lý nên cystatin C được lọc tự do qua cầu thận, sau đó được tái hấp thu và chuyển hóa hoàn toàn ở tế bào ống lượn gần. Bình thường, cystatin C trong nước tiểu rất thấp, từ 0,03-0,3mg/L, có chức năng bảo vệ, ngăn sự tạo mô liên kết gây ra bởi sự suy giảm của enzym nội bào sinh ra từ những tế bào chết, hoặc các rối loạn do sự bài tiết của tế bào ác tính. Do đó, cystatin C là một chất nội sinh có đủ điều kiện của chất chỉ điểm dùng để ước lượng độ lọc cầu thận [50],[54],[63],[80],[102].
1.4.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến cystatin C
Trong một số công trình nghiên cứu quan tâm đến ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau về sự sản xuất và bài tiết cystatin C cho thấy tốc độ sản xuất cystatin C không bị thay đổi bởi quá trình viêm. Sự thay đổi nồng độ cystatin C ở người khỏe mạnh thì ít, khoảng 5-7% [80]. Điều này đã được kiểm tra ở những bệnh nhân lớn tuổi mắc bệnh lây nhiễm cấp tính có mức độ protein phản ứng CRP cao (CRP: C reactive protein). Sau vài ngày theo dõi, các tác giả nhận thấy CRP giảm nhưng mức độ cystatin C không thay đổi. Đặc điểm này chứng tỏ cystatin C không phải là chất phản ứng trong giai đoạn cấp tính [31],[33]. Tuy nhiên, Coll và cộng sự tìm thấy ở người bị nhiễm HIV có nồng độ cystatin C cao. Ngoài ra, các nghiên cứu này đã chứng minh rằng dexamethasone làm tăng đáng kể ScysC, glucocorticoid, liposaccharid, inteferon γ, hút thuốc lá và yếu tố TGF-β (Transforming growth factor β) cũng có ảnh hưởng trên sự sản xuất cystatin C[80].
Nghiên cứu của Fricker M. (2003), Stojanoski S (2011) và Velibor (2012) trên bệnh nhân cường giáp hoặc suy giáp thấy rằng cường giáp là yếu tố làm tăng nồng độ ScysC và nhược giáp gây tác dụng ngược lại, khi điều trị cường giáp bằng kháng giáp tổng hợp hoặc điều trị suy giáp bằng hormon giáp đều cũng cho thấy nồng độ cystatin C huyết thanh thay đổi theo chiều ngược lại của quá trình hai bệnh lý này[80],[120]. Ngược lại, Bokenkamp A. và cộng sự (2002) nghiên cứu trên nhóm 12 bệnh nhân hội chứng thận hư điều trị tấn công bằng corticosteroid thấy rằng nồng độ ScysC sau điều trị biến đổi không có ý nghĩa so với trước điều trị, corticosteroid liều cao có thể có ảnh hưởng đến nồng độ ScysC ở BN điều trị nhưng sự biến đổi là không nhiều hoặc có thể hiệu chỉnh bởi hiệu quả điều trị làm cải thiện chức năng thận [32],[33],[66],[80].
Theo hiệp hội sức khỏe Canada, ScysC hầu như không bị ảnh hưởng bởi tuổi (đối với những người trên 1 tuổi), khối lượng cơ, giới tính và chủng tộc. Cũng
theo hiệp hội này, nồng độ ScysC nhạy cảm với sự thay đổi chức năng tuyến giáp [31],[32],[66],[80].
1.4.3 Phương pháp đo cystatin C huyết thanh
Lần đầu tiên việc đo cystatin C dựa trên điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis). Năm 1970, Lofberg và cộng sự đưa ra phương pháp khuếch tán miễn dịch phóng xạ được khuếch đại enzym (Enzyme amplified single radial immunodiffusion: SRID) để định lượng cystatin C với các tiêu chuẩn hiện đại. Phương pháp này tốn nhiều thời gian và đo được nồng độ cystatin C rất thấp. Về sau các phương pháp như miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay: RIA), phương pháp miễn dịch enzym (Enzymeimmunoassay: EIA) đã cho kết quả chính xác hơn, nhưng vẫn rất chậm [79], [80].
Từ năm 1994-1997, hai phương pháp hoàn toàn tự động đã được sử dụng đó là PETIA (Particle-enhanced turbidimetric immunoassay: xét nghiệm miễn dịch đục tăng cường hạt) và PENIA (Particle – Enhanced – Nephelometric Immunoassay: xét nghiệm miễn dịch thận tăng cường hạt). Những phương pháp này cho kết quả chính xác, nhanh và tiện lợi trong thực hành lâm sàng hằng ngày [36],[48],[79],[80],[99],[101].
Trong phương pháp PETIA, cystatin C người được tái tổ hợp trong điều kiện khô lạnh để định chuẩn và xác định nồng độ. Hệ số biến thiên (coefficient of variation: CV) của phương pháp này là 1,3-3,2% với phạm vi phân tích là 0,4- 14,1mg/L [36],[48],[79],[80],[99],[101].
Trong phương pháp PENIA, dùng cystatin C tinh khiết của người để định chuẩn. Hệ số biến thiên (CV) là 3-5% với phạm vi phân tích là 0,23-7,25mg/L. Phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi hemoglobin, bilirubin và triglyceride [36],[48],[79],[80],[99],[101].
Phương pháp “Test Elisa cystatin C (Enzyme-linked-immunosorbent assay”) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên quan đến men, để định lượng nồng
độ cystatin C trong mô và trong các dịch cơ thể theo quy trình: các giếng (well) được phủ bởi các kháng thể đa dòng của thỏ đặc hiệu với cystatin C người (pha rắn). Các mẫu chuẩn (calibrator), mẫu chứng (control) và mẫu thử lần lượt được cho vào các giếng thích hợp trong quá trình ủ kháng nguyên (cystatin C) sẽ gắn kết với kháng thể tại pha rắn trong các giếng. Các chất không gắn kết sẽ được rửa đi. Sau đó, kháng thể đơn dòng của chuột có gắn với peroxidase được thêm vào các giếng sẽ kết hợp với phức hợp kháng nguyên-kháng thể có sẵn sẽ tạo nên phức hợp dạng sandwich (kháng thể thỏ-cystatin C-kháng thể chuột). Phần không gắn kết sẽ được rửa đi bởi lần rửa thứ 2. Phức hợp gắn kết enzym (sandwich) sẽ được phát hiện bằng cách ủ với dung dịch TMB (3, 3’, 5, 5’tetramethylbenzidine và hydrogen peroxide) để tạo dung dịch có màu xanh nước biển, màu xanh sẽ chuyển sang màu vàng bằng cách dừng phản ứng bởi acid sulfuric. Đậm độ màu được đo bởi máy Maplab plus ở bước sóng 540nm sẽ tỷ lệ với nồng độ cystatin C trong mẫu [80],[114]. Ngoài ra, hiện nay đa số các phòng xét nghiệm trên thế giới đều sử dụng phương pháp đo độ đục latex (Latex turbidimetry) với hệ số biến thiên <1,8% [80].
1.4.4 Các giá trị tham khảo của cystatin C huyết thanh
- Ở trẻ em: nồng độ ScysC cao nhất sau khi sinh và giảm nhanh sau vài tuần. Theo Plebani và cs, cystatin C không qua màng nhau thai và nồng độ ScysC cao sau khi sinh, có thể phản ánh mức độ trưởng thành của khả năng lọc cầu thận. Nồng độ ScysC ổn định dần sau năm đầu tiên và không có sự khác nhau về giới tính. Ngược lại, nồng độ creatinin huyết thanh cao sau sinh vài tuần, sau đó tăng đều theo tuổi đến tuổi trưởng thành và có sự khác biệt giữa nam và nữ. Theo Bokemkamp và cộng sự, ở trẻ em trên một tuổi nồng độ ScysC khoảng 0,7-1,38mg/L, Groesbeck D (2008) nghiên cứu trên 719 người khỏe mạnh ở lứa tuổi thanh thiếu niên thấy nồng độ trung bình ScysC là 0,84 mg/l, giảm đi theo lứa tuổi từ 12–19, ở nam cao hơn ở nữ, điều này ngược lại so với creatinin huyết thanh [36],[48],[79],[80],[99],[101].
- Ở người trưởng thành: hầu hết giá trị tham khảo dựa vào giới hạn của số cá thể. Sự khác biệt về số liệu giữa nhiều tài liệu tham khảo chính là vì có sự khác biệt trong phương pháp chuẩn hóa, cải tiến đặc trưng của kháng thể dùng trong từng phương pháp và khác nhau về độ chính xác của các phương pháp. Một số tài liệu tham khảo về ScysC sử dụng phương pháp PETIA tính được giá trị là 0,54-1,21mg/L, phù hợp với nghiên cứu của Norlund và cộng sự, cả hai dữ liệu trên được IFCC (International Federation of clinical Chemistry and Laboratory Medicine) xác nhận [80],[81]. Theo Al Wakeel J.S (2008), cystatin C trên người trưởng thành có nồng độ trung bình 0,751
± 0,11 mg/l, tăng dần theo tuổi [25]. Ngoài ra, Odden M.C. và cộng sự (2010) phân tích trên 18.000 người trưởng thành và cao tuổi thấy rằng có mối liên quan tuyến tính chặt chẽ giữa tuổi với nồng độ ScysC, giá trị trung bình nồng độ ScysC ở nhóm tuổi trên 80 cao hơn 46% so với tuổi dưới 40 [80].
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Lệ (2007) thì giá trị ScysC tính theo phương pháp Elisa (Enzyme-linked-immunosorbent assay) ở người trưởng thành bình thường (từ 18 tuổi đến trên 60 tuổi) là: 0,54-0,65mg/L ở nam và 0,52- 0,64mg/L ở nữ [11],[17].
Còn theo phương pháp đo độ đục hạt latex (test Latex turbidimetry cystatin C) thì giá trị của cystatin C đo được trên 30 người trưởng thành bình thường trong nghiên cứu của Nguyễn Hồng Hà (2010) tuổi từ 25 đến 54 tại khoa Sinh hóa Bệnh viện Chợ Rẫy là 0,76±0,34mg/L(với SD: 0,009-0,01mg/L) [4]. Tương tự khi dùng phương pháp trên, tác giả Trần Thái Thanh Tâm (2017) nghiên cứu trên 119 người khỏe mạnh tham gia hiến thận thì giá trị trung bình nồng độ của ScysC trong nghiên cứu này là 0,8±0,13mg/L [20].
Bảng 1.1: Giá trị tham khảo cystatin C huyết thanh ở người bình thường Đối tượng Giá trị (mg/L) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tác giả nghiên cứu
Nam Nữ
Nguyễn Thị Lệ và 18-60 tuổi 0,54-0,65 0,52-0,64 Trần Thị Liên Minh [11]
Nguyễn Hồng Hà [4] 25-54 tuổi 0,76±0,34
Trần Thái Thanh Tâm [20] 25-54 tuổi 0,8±0,13mg/L
Dako clinic [48] 20-50 tuổi 0,70-1,21
> 50 tuổi 0,84-1,55 1-18 tuổi 0,70-1,38
Norlun và cs [81] > 18 tuổi 0,54-1,21
Bokenkamp và cs [80] > 1 tuổi 0,70-1,38
1.4.5 Các nghiên cứu về cystatin C khi đánh giá độ lọc cầu thận trên thế giới
Năm 1985, cystatin C lần đầu tiên được dùng để xác định GFR bởi Simonsen và cộng sự [100]. Các tác giả nhận thấy nồng độ cystatin C có tương quan tuyến tính với độ thanh lọc 51Cr-EDTA ở các mức độ suy giảm chức năng thận trong các loại bệnh thận khác nhau và nồng độ ScysC tăng trong khi GFR giảm. Những nghiên cứu khác trên các bệnh nhân có chức năng thận bình thường đến suy thận nặng đã cho thấy ScysC là một chất tốt để đo GFR như Scr. Gần đây, các kỹ thuật đồng vị phóng xạ cũng góp phần khẳng định ScysC có tính chất trội hơn so với Scr. Kết luận dựa vào hệ số tương quan, độ nhạy và độ đặc hiệu. Tian và cộng sự đã chứng minh cystatin C giúp phát hiện sự giảm GFR sớm hơn creatinin huyết thanh [37],[48],[52],[59],[70],[71],[74],[80].
Năm 1998, Bokenkamp A., Helin I. đã dùng độ thanh lọc 51Cr-EDTA như một tiêu chuẩn vàng khi so sánh ScysC với creatinin huyết thanh. Các tác giả cũng cho thấy cystatin C không phụ thuộc vào giới tính, thai kỳ,tuổi tác, chiều cao, cân nặng [24],[59],[60],[80].
Các nghiên cứu ban đầu đã chứng minh, ScysC là chất để xác định GFR ở những bệnh nhân ghép thận. ScysC tăng đáng kể khi độ thanh lọc creatinin 24 giờ giảm ở các bệnh nhân này [20],[52],[65],[71],[80],[87],[106].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã đánh giá GFR trên bệnh nhân đái tháo đường hay tăng huyết áp cũng đều cho thấy vai trò rất quan trọng của cystatin C [29],[58],[59],[70],[83],[85],[86],[88],[95],[106],[110].
Trong các nghiên cứu khác, các tác giả đã dùng cystatin C trong huyết thanh để đánh giá độ lọc cầu thận ở các bệnh nhân xơ gan mất bù [84],[112]. Kết quả cho thấy, nồng độ ScysC là một chỉ số tin cậy để đánh giá GFR trong các giai đoạn nặng của xơ gan hơn là creatinin, vì ScysC không bị ảnh hưởng bởi xơ gan mất bù. Hiện nay, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh ScysC với sự giảm GFR sớm thì có mối tương quan chặt chẽ giữa cystatin C huyết thanh và GFR, không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố viêm nhiễm, tuổi, giới. Do vậy, cystatin C được xem là chất lý tưởng để đo GFR [31],[32],[80],[98].
1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO ĐỘ LỌC CẦU THẬN BẰNG KỸ THUẬT PHÓNG XẠ
Do độ thanh lọc inulin quá phức tạp, còn ĐTLcre24giờ và ĐTLcreƯĐ từ creatinin huyết thanh tiện dụng nhưng không chính xác, vì vậy các kỹ thuật phóng xạ và dược chất phóng xạ được quan tâm nghiên cứu [73],[80].
1.5.1. Các dược chất phóng xạ dùng trong nghiên cứu chức năng thận
Dược chất phóng xạ trong chẩn đoán gồm 2 thành phần: chất phóng xạ và chất gắn [6],[7],[10],[18],[46],[73],[80].
- Chất phóng xạ: là các chất phóng ra tia gamma. Chất phóng xạ thường được chọn là 99mTechnetium (99mTc) và 131Iod hoặc 125Iod. 99mTc là dược chất phóng xạ có chu kỳ bán huỷ ngắn (6 giờ), năng lượng phát xạ thấp (140keV) nên được phép dùng với liều cao từ 111Mbq đến 140Mbq để cho hình ảnh đẹp, dễ sản xuất bằng việc chiết xuất dược chất phóng xạ bằng bình sinh xạ, do đó là chất được ưu tiên lựa chọn trong Y Học Hạt Nhân. 131Iod có chu kỳ bán huỷ dài hơn (8 giờ), năng lượng phát xạ cao hơn (364keV) và cho hình ảnh kém hơn. Còn 125Iod có năng lượng phát xạ thấp hơn (35keV) nhưng chu kỳ bán huỷ dài (60 giờ) thích