Theo nghiên cứu Landi Librandi, A. P và cộng sự (2018) TSP đã được tìm thấy có chức năng làm giảm cholesterol huyết thanh và nồng độ đường trong máu ở chuột [17, 50], từ đó dựa trên nghiên cứu ở con người TSP có thể trì hoãn sự tiến triển của nhiễm fluor trong xương [12, 51].
Theo Huimin Shao và cộng sư (2008) đã nghiên cứu một polysacarit được chiết xuất từ hạt me (TSP) bằng nước nóng, dịch chiết có tính acid và kết tủa với ethanol. Kết quả phân tích dao động động, độ nhớt biểu kiến và các thông số độ nhớt chỉ ra rằng TSP sở hữu khả năng kháng pH, ổn định nhiệt tuyệt vời khi TSP kết hợp với pectin có lượng methoxyl cao (6,8-8,4%), phù hợp với ngành hóa dược [32].
Theo như Rupali Singh và cộng sự (2011) đã nghiên cứu tính chất keo của polysacarit được chiết xuất với dung môi nước, kết quả thu được từ các nghiên cứu cho thấy quy trình sử dụng có hiệu quả để chiết xuất gum từ hạt me, dễ dàng dự đoán rằng polymer chiết xuất có thể được sử dụng làm tá dược dược phẩm(b) về các đặc tính vi mô [52].
TSP đã được xác định là chất không gây ung thư, là chất kết dính có nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả năng giữ thuốc cao. TSP được sử dụng như chất kết dính ở dạng viên, dạng gel, tác nhân làm dày, như chất nhũ hóa và làm chất ổn định trong thực phẩm, và được sử dụng trong các ngành công nghiệp dược phẩm, thực
16
phẩm [53]. Một số kết quả nghiên cứu TSP và sản phẩm biến tính của TSP đã thể hiện tốt khả năng làm chất mang cho thuốc và kiểm soát liều lượng phân tán thuốc vào cơ thể [54]. Người ta đã tạo dẫn chất sulfate hóa và cetyl hóa của polysaccharide để làm tăng khả năng chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định [55, 56].
Năm 2010 Nagwa Ammar đã khẳng định TSP chiết từ hạt me có khả năng ổn định huyết áp và lipid máu đã được thử nghiệm trên bệnh nhân cao huyết áp [57, 58]. Ngoài ra TSP tăng cường khả năng chống viêm và làm thuốc giảm đau. Hỗn hợp của TSP và acid hyaluronic là nước mắt nhân tạo được sử dụng cho hội chứng khô mắt. TSP có thể được sử dụng là thành phần chính trong thuốc kháng sinh ưa nước và kị nước.
(a) Polysacarit được chiết xuất từ hạt me (TSP) là một galactoxyloglucan mà tỷ lệ galactose: xyloza: glucose là 1: 2,25: 2,8, có trọng lượng phân tử cao (400-6000 kDa). Một polysacarit nhỏ (từ 2 - 3%) chứa phân nhánh (1→5) -α- l -arabinofuranan và không phân nhánh (1→4) -β- d -galactopyranan [59, 60]. TSP chiếm khoảng 65% thành phần hạt me phụ thuộc vào nguồn gốc [61].
(b) Tá dược là phần quan trọng cho dược phẩm, cũng có thể nói nó là một phần không thể thiếu của sản phẩm thuốc. Đây là các phân tử trơ đóng vai trò rất quan trọng trong thiết kế một dược liệu cho hiệu quả tối ưu với đối tượng sử dụng [43] .
1.2 Định hƣớng nghiên cứu
1.2.1 Những vấn đề tồn tại
Hạt me là phụ phẩm trong công nghiệp bột me, nước ép me, kẹo me. Tuy nhiên, hạt không chỉ là nguồn dinh dưỡng giàu protein (16-25%), chứa một lượng lớn các acid amin và còn là nguồn cung cấp acid béo, muối vô cơ, đặc biệt là các khoáng canxi, kali,... Ngoài ra, tận dụng nguồn hạt me làm phụ phẩm trong công nghiệp cũng làm giảm ô nhiễm môi trường. Tuy vậy việc phân lập và định danh những hợp chất có trong hạt me tại Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.
Theo như các bài báo đã đăng trên tạp chí khoa học công nghệ của TS. Phan Thị Anh Đào và cộng sự (2015), Bùi Ngọc Tân và cộng sự (2017), Urszula Trila, Juana Fernández-López và cộng sự (2014), Rupali Singh và cộng sự (2011) đã công bố rằng hạt me có hoạt tính sinh học rất cao trong các loại hạt thực vật nhưng tại Việt Nam vẫn chưa có sản phẩm dựa trên tiềm năng hoạt tính sinh học vốn có của hạt me [14, 27, 52].
17
khả năng ứng dụng làm chất mang, tá dược trong thuốc. Các thành phần hoạt tính sinh học khác liên quan tới các polyphenol trong hạt me chưa được nghiên cứu nhiều.
1.2.2 Định hướng nghiên cứu
Từ những nhận định trên, chúng tôi đưa ra định hướng cho nghiên cứu của mình như sau:
Hạt T. indica đã được nghiên cứu về thành phần hóa học trên thế giới theo định hướng phân lập alkaloid. Chúng tôi tập trung theo hướng phân lập các hoạt chất kháng oxy hóa.
Nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Thu thập mẫu hạt me.
2. Trích ly các hợp chất từ bột cây.
3. Điều chế các loại cao có độ phân cực tăng dần từ cao tổng. 4. Phân lập một số hợp chất tự nhiên từ cao etyl acetate.
5. Xác định cấu trúc hóa học và định danh các hợp chất đã phân lập bằng phổ 1D-NMR (1H,13C-NMR), 2D-NMR (HSQC, HMBC).
18
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1 Hóa chất và thiết bị
2.1.1 Hóa chất
Dung môi: hexan, chloroform, etyl acetate, acetone, methanol (Chemsol, Việt Nam), Công ty TNHH giải pháp hóa học VINA.
Hóa chất khác: thuốc thử hiện hình vết trên sắc ký lớp mỏng: vanillin/ H2SO4, H2SO4 30%, nung nóng, acid acetic
Sắc ký lớp mỏng pha thường: TLC silica-gel 60 F254 (250µm, Merck) Sắc ký cột pha thường: silica-gel 60 (0,0400,063 mm, Himedia)
2.1.2 Thiết bị (b)
Cột sắc ký, cốc giải ly
Cột Pasteur pippet (0,7 cm i. d. x 10 cm) được nhối silica gel Merck (cỡ hạt 15- 40 um ) ( Merck , Darmstadt , CHLB Đức )
Bình triển khai sắc ký lớp mỏng
Đèn UV (Spectroline model ENF-240C/FE, USA) bước sóng 254nm và 352nm Cân phân tích 4 số lẻ, xuất xứ Thụy Sỹ, model: LS320A
Cân phân tích 2 số lẻ, xuất xứ Thụy Sỹ, model: LS320C Tủ sấy, xuất xứ Đức, model : UN110
Bể điều nhiệt, xuất xứ Đức, model : WNB29
Tủ hút khí độc, xuất xứ Indonesia, model : EFH - 4A8 Máy nước cẩt một lần xuất xứ Anh, model : WSB/4 Máy nước cẩt hai lần xuất xứ Anh, model : WSC/4D
Máy cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Avance) với tần số 500 MHz cho phổ 1HNMR và 125 MHz MHz cho phổ 13CNMR(a) Bruker Avance 500 với chất nội chuẩn tetrametylsilan (TMS)
Hệ thống cô quay chân không Heidolph, xuất xứ Đức.
Hệ thống cô quay chân không amamoto, xuất xứ Nhật Bản, model:RE 601B. a) Mẫu hợp chất thiên nhiên được gửi đo các phổ NMR, HSQC, HMBC, DEPT tại
phòng Phân tích Trung tâm, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia, TP. Hồ Chí Minh.
19
b) Tất cả thiết bị và thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm hữu cơ B109 khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm tại trường đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Các phương pháp xử lý mẫu và trích ly
Sử dụng phương pháp ngâm dầm để điều chế cao methanol. Sau khi có được phần cao chiết methanol, sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với dung môi etylacetat , thu được cao etylacetat.
2.2.2 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp
chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các phần chiết, định hướng phân tách các phần chiết, đặc trưng các hợp chất và kiểm tra độ sạch của các hợp chất phân lập.
Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên.
Sắc ký cột thường (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi.
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu về cấu trúc
Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).
Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) với chương trình DEPT. Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm.
20
2.3 Thực nghiệm
2.3.1 Điều chế các loại cao
a) Nguyên liệu
8 kg bột hạt của cây me được thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh vào tháng 9 năm 2018.
b) Điều chế cao methanol
Mẫu thực vật sau khi thu hái sẽ được rửa sạch và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60oC đến khi độ ẩm 10% thì ngưng và xay thành bột mịn, bột nguyên liệu được ngâm với methanol nhiều lần ở nhiệt độ phòng. Dịch trích được lọc qua giấy lọc, gộp lại và thu hồi dung môi ở áp suất kém để thu được cao trích methanol thô (1 kg).
Sơ đồ 2.1: Quá trình điều chế cao methanol
c) Điều chế cao phân đoạn
Phần cao methanol thô được phân tán vào trong một lượng nhỏ nước để tạo dịch sệt rồi tiến hành trích lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi với độ phân cực tăng dần hexan, chloroform và ethyl acetate. Các phần dịch trích được thu hồi ở áp suất kém lần lượt thu được cao hexan, chloroform, ethyl acetate và cắn nước (sơ đồ 2.2). Khối lượng và thu suất của các loại cao được thể hiện qua bảng 2.1.
Cô quay áp suất thấp
Sấy 600C; xay; ngầm dầm với methanol Mẫu cây
Dịch trích
21
Sơ đồ 2.2: Quá trình chiết cao phân đoạn
- Chiết lỏng-lỏng với dung môi chloroform. - Cô quay dich chiết áp suất thấp.
- Chiết lỏng-lỏng với dung môi ethyl acetate. - Cô quay dich chiết áp suất thấp.
- Chiết lỏng-lỏng với dung môi hexan. - Cô quay dich chiết áp suất thấp.
Cao methanol
Cao hexan Dịch nước
Cao chloroform Dịch nước Cao ethyl acetate Cắn
22
Bảng 2.1: Khổi lượng của các loại cao.
Loại cao
Hạt Tamarindus indica (L.)
Khối lượng (g) Thu suất (%)
Nguyên liệu thô ban đầu 8000 -
methanol 1000 12.50
Hexan 3 0.04
Chloroform 15 0.19
Ethyl acetate 70 0.88
Nước 900 11.25
2.3.2 Phân tách thành phần cao phân đoạn ethyl acetate
2.3.2.1 Sử dụng phương pháp TLC để theo dõi tiến trình
Phần chiết cao ethyl acetate được phân tích với TLC với hệ giải ly là hỗn hợp dung môi chloroform: methanol với tỷ lệ 9:1 và hexan:acetone với tỷ lệ 7:3. Phát hiện các vết chất trên bảng mỏng bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 và đèn UV ở bước sóng 254nm.
Lựa chọn tiến thành sắc ký cột cao chiết ethyl acetate với chất hấp phụ silica-gel pha thường, giải hấp bằng hệ dung môi chloroform:methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0-100%.
2.3.2.2 Tiến hành phân tách cao phân đoạn ethyl acetate bằng phương pháp CC
Phần trích ethyl acetate (70 g) được hòa tan trong một lượng methanol vừa đủ và được tiền hấp phụ bằng silica-gel (1:2) cho ra một chất bột mịn màu nâu.
Nhồi silica-gel bằng phương pháp nhồi cột ướt vào cột tách CC đến độ cao 65cm. Đưa mẫu đã tiền hấp phụ bằng silicagel vào cột, giải hấp bằng hệ 2 dung môi chloroform:methanol, thu các phân đoạn theo 100 ml/phân đoạn. Tiến hành phân tích những phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC, gộp lại và thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được 7 nhóm phân đoạn chính được ký hiệu từ TI-A đến TI-G.
23
Bảng 2.2: Khối lượng và hiệu suất thu hồi của nhóm phân đoạn cao Ethyl acetate. Thứ
tự
Phân đoạn
Cao chiết Ethyl acetate Dung môi giải ly Kết quả SKBM Ghi chú Khối lượng (g) Hiệu suất (%)
1 TI-A 31,863 41,38 E:M:N Vết loang,
không rõ
Chưa khảo sát
2 TI-B 5,341 6,93 E:M:N Vết loang,
không rõ
Chưa khảo sát
3 TI-C 10,47 13,60 E:M:N Vết tách rõ Khảo sát
4 TI-D 3,942 5,12 E:M:N Vết tách rõ Khảo sát
5 TFI-E 8,637 11,21 E:M:N Vết tách rõ Chưa khảo
sát
6 TI-F 4,161 5,40 E:M:N Vết tách rõ Khảo sát
7 TI-G 2,02 2,62 E:M:N Vết tách rõ Chưa khảo
24
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ điều chế cao phân đoạn
2.3.3 Phân tích thành phần phân đoạn TI- F của cao ethyl acetate
2.3.3.1 Sử dụng phương pháp TLC để theo dõi tiến trình
Phân đoạn TI-F của cao trích ethyl acetate được phân tích bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC với hệ giải ly là hỗn hợp 2 dung môi ethyl acetate: methanol với tỷ lệ 9:1, ethyl acetate: acetone tỷ lệ 8:2. Phát hiện các vết chất trên bản mỏng bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 và máy UV với bước sóng 254nm.
Lựa chọn hệ dung môi tiến hành sắc ký cột là ethyl acetate:methanol tăng nồng độ methanol với chất hấp phụ là silica-gel pha thường, theo dõi quá trình sắc ký bằng TLC.
2.3.3.2 Tiến hành phân tách bằng phương pháp CC
Hòa tan cao phân đoạn F với một lượng methanol vừa đủ và tiền hấp phụ bằng silica-gel thu được bột mịn màu nâu.
Tiến hành nhồi silica-gel băng phương pháp nhồi cột ướt với dung môi ethyl acetate vào cột sắc ký ( đường kính 50 cm, chiều dài 75 cm).
Đưa mẫu đã tiền hấp phụ vào cột sắc ký, giải hấp bằng hệ dung môi ethyl acetate: methanol, lượng dung môi methanol tăng từ 0 đến 100%, thu các phân đoạn theo 20ml/phân đoạn.
Sắc ký cột với dung môi C:M Hệ dung môi giải ly: H:A; E:M:N Cao ethyl acetate
Phân đoạn TI-A 31.8 g Phân đoạn TI-B 5.3 g Phân đoạn TI-C 10.4 g Phân đoạn TI-D 3.9 g Phân đoạn TI-E 8.6 g Phân đoạn TI-F 4.1 g Phân đoạn TI-H 2.0 g
25
Hình 2.1: Tiến hành gom mẫu để được các phân đoạn
Theo dõi quá trình sắc ký, gom phân đoạn bằng TLC, thu hồi dung môi ở áp suất kém. Thu được 3 phân đoạn, ký hiệu từ TI-F1 đến TI-F3.
Bảng 2.3: Khối lượng và hiệu suất của phân đoạn TI-F1 đến TI-F3 Thứ
tự
Phân đoạn Phân đoạn F Dung môi giải ly Kết quả SKBM Ghi chú Khối lượng (g) Hiệu suất (%) 1 TI-F1 2,413 57,99 E: M: N Vết rõ, đậm Khảo sát 2 TI-F2 0,550 13,22 E: M: N Vết rõ, đậm Khảo sát 3 TI-F3 0,896 21,53 E: M: N Vết không rõ, kéo Không khảo sát
26
2.3.4 Phân tách thành phần từ phân đoạn TI-F1
Phân tách thành phần phân đoạn F1 bằng TLC với hệ giải ly ethyl acetate:methanol:nước theo tỷ lệ 6:1:1. Phát hiện vết trên TLC băng thuốc thử vanillin/H2SO4 và máy UV với bước sóng 254nm.
Nhồi silica-gel pha thường bằng phương pháp nhồi cột ướt với hỗn hợp 2 dung môi hexane:etyl acetate tỷ lệ 1:1 và cột sắc ký ( đường kính 2 cm, chiều cao 50cm).
Hòa tan mẫu với một lượng etyl vừa đủ để mẫu tạo huyền phù. Tiến hành nạp mẫu lỏng vào cột sắc ký, giải hấp với hệ dung môi hexane : ethyl acetate tăng etyl acetate từ 50 % đến 100 % . Thu các phân đoạn theo 5ml/phân đoạn, theo dõi quá trình sắc ký bằng TLC. Thu được 3 phân đoạn, ký hiệu từ F1.1 đến F1.3.
Bảng 2.4: Khối lượng và hiệu suất của phân đoạn TI-F1 đến TI-F3 Thứ
tự
Phân đoạn Phân đoạn F Dung môi giải ly Kết quả TLC Ghi chú Khối lượng (g) Hiệu suất (%) 1 TI-F1.1 1,026 57,99 E: M: N Vết rõ, đậm Khảo sát 2 TI-F1.2 0.550 13,22 E: M: N Vết rõ, đậm Khảo sát 3 TI-F1.3 1,496 21,53 E: M: N Vết không rõ, kéo Không khảo sát
2.3.5 Phân tách thành phần từ phân đoạn TI-F1.1
Phân tách thành phần phân đoàn TI-F1.1 bằng TLC với hệ giải ly etyl acetate theo tỷ lệ 100%. Phát hiện vết trên TLC băng thuốc thử vanillin/H2SO4 và máy UV với bước sóng 254nm.
27
Sơ đồ 2.3: Tóm tắt quy trình thực hiện Sắc ký cột với dung môi E:A
Hệ dung môi giải ly: E
Sắc ký cột với dung môi E:M:N Hệ dung môi giải ly: E:M:N
Sắc ký cột với dung môi C:M Hệ dung môi giải ly: H:A; E:M:N Cao ethyl acetate
Phân đoạn TI-A 31.8 g Phân đoạn TI-B 5.3 g Phân đoạn TI-C 10.4 g Phân đoạn TI-D 3.9 g Phân đoạn TI-E 8.6 g Phân đoạn TI-F 4.1 g Phân đoạn TI-H 2.0 g Phân đoạn TI-F2 2.41 g Phân đoạn TI-F1 0.55 g Phân đoạn TI-F3 0.89 g
Phân đoạn TI- F1.2 0.085g
Phân đoạn TI- F1.1 0.053g
Phân đoạn TI- F1.3 0.068g
28
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát phân đoạn TI-F của cao ethyl acetate được điều chế từ hạt me (Tamarindus indica L.) đã phân lập và định danh được 01 hợp chất.
3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất TI-F1A
Đặc điểm
Hợp chất TI-F1A (14.8 mg) thu được từ phân đoạn TI-F1.1 (sơ đồ 2.3), có những đặc điểm như sau:
- Dạng bột màu vàng, tan trong dung môi acetone. TLC pha thường với hệ dung môi etyl acetate : acetone (9:1) thấy hiện vết tròn với Rf = 0,65 và hấp thu UV.