Quy trình cơng nghệ sản xuất tế bào CAR-T trong điều trị ALL

Một cách khái quát, quy trình sản xuất tế bào CAR-T bắt đầu bằng việc thu tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) từ người bệnh thơng qua “leukapheresis”. Từ quần thể tế bào ban đầu, các tế bào CD3+ cĩ thể được làm giàu ex vivo và được chuyển gen nhằm biểu hiện cấu trúc CAR hướng đích kháng nguyên là thụ thể của tế bào ung thư. Các tế bào T sau đĩ được tăng sinh trong mơi trường nuơi cấy rồi được kiểm tra chất lượng trước khi được truyền lại vào cơ thể người bệnh.

1.3.1. Thu tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) và làm giàu quần thể tế bào T

Cho đến nay, “leukapheresis” vẫn là phương pháp hiệu quả nhất để cĩ được lượng tế bào T ban đầu đủ lớn cho các giai đoạn tiếp theo. Phương pháp này bao gồm lấy máu tồn phần từ người bệnh và ly tâm tỷ trọng nhằm phân tách các thành phần máu. Sau đĩ, phân lớp tế bào PBMC (chứa lymphocyte và monocyte) được hút ra để sử dụng cho các bước tiếp theo. Đây là cách tiếp cận phổ biến nhất hiện nay do đã được FDA cơng nhận.

1.3.2. Kích hoạt tế bào T

Trong điều kiện tự nhiên, tế bào T “nạve” được kích thích tăng sinh và biệt hĩa nhờ các tế bào trình diện kháng nguyên (APCs), thơng qua tương tác của thụ thể tế bào T TCR và phân tử MHC và các phân tử đồng kích thích như CD28, CD137, và OX-40 nằm trên bề mặt tế APCs. Dựa vào quá trình kích thích tế bào T trong tự nhiên, các phương pháp kích hoạt và tăng sinh tế bào T trong cơng nghệ tế bào CAR-T đã được phát triển [66]. Phổ biến nhất cĩ thể kể đến (i) sử dụng kháng thể đơn dòng kết hợp với interleukin, (ii) bi từ gắn kháng thể kháng CD3/CD28 (kết hợp với interleukin), và (iii) tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (aAPCs).

15 Trong sản xuất tế bào CAR-T, quần thể tế bào thu được sau “leukapheresis” thường được kích hoạt và tăng sinh bằng bi từ gắn anti-CD3/CD28 trước và sau khi tải nạp [67]. Ngồi ra, các hạt bi từ cĩ thể được dễ dàng loại bỏ khỏi mơi trường nuơi cấy bằng nam châm [68].

1.3.3. Chuyển gen tạo tế bào CAR-T

Chuyển gen là bước tối quan trọng trong sản xuất tế bào CAR-T, quyết định hiệu quả của liệu pháp điều trị cũng như giá thành sản xuất. Hiện nay, cĩ rất nhiều phương pháp chuyển gen cĩ thể được áp dụng vào tế bào T như tải nạp bằng vector vi rút, transposons, hoặc sử dụng hạt nano, liposome, kỹ thuật xung điện (electroporation). Tuy nhiên, cĩ hai loại phương pháp chính đã được thử nghiệm lâm sàng là tải nạp bằng vi rút và transposon-transposase kết hợp với kỹ thuật xung điện.

 Tải nạp bằng vector vi rút

Tải nạp bằng vector vi rút hiện đang là phương pháp phổ biến để tạo tế bào CAR-T. Các vector vi rút bao gồm retrovirus (lentivirus và γ-retrovirus) và adenovirus cĩ khả năng lây nhiễm nhưng khơng còn khả năng nhân bản. Quy trình sản xuất vector vi rút đạt chuẩn GMP rất phức tạp và phải được thực hiện trong mơi trường vơ trùng. Để sản xuất một mẻ vector vi rút thường cần hai tuần. Hầu hết thời gian trên được dành cho việc tạo đủ lượng tế bào vật chủ, cĩ thể là HEK293T hoặc PG13 để phục vụ quá trình “đĩng gĩi” vi rút. Đầu tiên, các tế bào vật chủ được tăng sinh trên mơi trường nuơi cấy thích hợp đến liều lượng nhất định trước khi được chuyển nạp với 4 plasmid bao gồm: (i) cấu trúc Gag/Pol mã hĩa protein Gag và enzyme Pol của vi rút; (ii) cấu trúc mã hĩa lớp vỏ glycoprotein dị nguyên đã được thiết kế nhằm loại bỏ khả năng nhân bản; (iii) cấu trúc mã hĩa gen

rev trong trường hợp sử dụng lentivirus; (iv) cấu trúc mã hĩa CAR và các trình tự khác nhằm đảm bảo hiệu quả phiên mã ngược, đĩng gĩi và tích hợp gen chuyển vào hệ gen vật chủ. Khoảng 48 giờ sau tải nạp, các hạt vi rút chứa cấu trúc CAR bắt đầu được tạo ra. Trong các ngày tiếp theo, vi rút cĩ thể được thu hoạch theo mẻ bằng cách thay mới mơi trường nuơi cấy. Sau đĩ, vector vi rút được tinh sạch và làm giàu bằng các bước lọc, loại bỏ cặn tế bào và các tạp chất khác, lọc vơ trùng và bảo quản ở -80oC. Trước khi sử dụng, các vector vi rút được kiểm tra chất lượng theo quy trình của FDA [69].

16 Ưu điểm của phương pháp tải nạp bằng vector vi rút là hiệu quả chuyển gen cao và sự tích hợp cấu trúc CAR vào hệ gen vật chủ một cách ổn định. Hai đặc trưng của retrovirus khiến chúng đặc biệt thích hợp để làm vector chuyển gen là: (i) phần lớn hệ gen vi rút cĩ thể được thay bằng một hoặc nhiều transgene mong muốn; (ii) khi chuyển nạp, bộ gen của vi rút được tích hợp vĩnh viễn vào hệ gen của tế bào vật chủ. Vì những lí do này, một số γ-retrovirus đơn giản như “Moloney murine leukemia virus” (Mo-MLV) đã được ứng dụng thành cơng để phục vụ tải nạp gen. Các lentivirus cũng thường được sử dụng và ngày càng được lựa chọn nhiều hơn so với γ-retrovirus, điển hình như các vector thiết kế dựa trên vi rút HIV. Thơng thường, tế bào T sẽ được hoạt hĩa bằng bi từ gắn kháng thể kháng OKT3, CD28 (hoặc Dynabead CD3/CD28) trước khi cho ủ với vector chuyển gen. Sau khi vi rút dung hợp với màng tế bào T, lõi vi rút mang cấu trúc CAR sẽ được chuyển vào tế bào chất, di chuyển dọc theo các vi ống đến nhân tế bào để thực hiện quá trình tích hợp với hệ gen vật chủ. Phương pháp này cho phép tạo tế bào CAR- T với hiệu suất lên đến 68% [70, 71].

Tuy nhiên, để đạt được những tiêu chí an tồn cao trong nghiên cứu lâm sàng, vector vi rút được sử dụng phải được chứng minh khơng cĩ khả năng nhân bản, ít gây độc tế bào và ít gây phản ứng miễn dịch. Vì thế, giá thành sản xuất của phương pháp này khá cao, tạo nên rào cản lớn trong việc sử dụng rộng rãi liệu pháp CAR, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển như Việt Nam.

 Transposon-Transposase

Transposon là các yếu tố di truyền kép, bao gồm một plasmid mang cấu trúc CAR và một plasmid mang gen mã hĩa transposase. Một số hệ thống điển hình cĩ thể kể đến như “Sleeping Beauty” (SB) và “piggyBac” thường sẽ được chuyển trực tiếp vào tế bào chủ bằng kỹ thuật xung điện nhằm tích hợp cấu trúc di truyền vào hệ gen của tế bào vật chủ một cách ổn định [72, 73]. Cơ chế của các phương pháp này (Hình 1.4) là enzyme transposase sẽ nhận biết và bám vào các vùng ITR (inverted termial repeats: trình tự lặp đầu cuối đảo ngược) tại hai đầu của cấu trúc cần chuyển, sau đĩ cắt và dán cấu trúc di truyền vào hệ gen tế bào chủ (hệ thống “Sleeping Beauty” sẽ cắt và dán gen chuyển vào vùng trình tự giàu TA trong hệ gen vật chủ).

17

Hình 1.4 Cơ chế hoạt động của hệ thống Sleeping Beauty [74]

So với các vector vi rút truyền thống, transposon cĩ ưu điểm cơ bản là giá thành sản xuất thấp hơn nhiều lần (do bản chất của các cấu trúc là các plasmid) và cĩ tính an tồn cao hơn. So với hệ thống “piggyBac”, “Sleeping Beauty” cĩ lợi thế hơn trong chuyển gen vào tế bào T do khả năng tích hợp ngẫu nhiên vào các vùng trình tự giàu TA trong hệ gen tế bào chủ; trong khi đĩ, cơng nghệ “piggyBac” thường tích hợp gen chuyển vào gần vùng điều hòa gen (regulatory region) như “Transcriptional start site” (TSS) và các đảo CpG [75].

Bằng cách sử dụng các dạng SB transposase cải tiến như SB100X, các nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả chuyển gen vào tế bào T là tương đương so với các vector vi rút [76]. Thơng thường, quần thể PBMC sẽ được kích hoạt trước khi chuyển nạp bằng kỹ thuật xung điện với hỗn hợp hai plasmid (một plasmid mã hĩa transposase và một plasmid mã hĩa cấu trúc CAR) hoặc một hỗn hợp bao gồm một plasmid mã hĩa cấu trúc CAR và một mRNA mã hĩa SB transposase. Lượng plamid mã hĩa CAR thường sử dụng từ 10 đến 20 µg kết hợp cùng với 5 µg plasmid hoặc 1 µg mRNA mã hĩa SB transposase [77, 78].

18 Việc chuyển nạp sử dụng mRNA cĩ một số lợi thế so với cách sử dụng DNA hay vi rút, ví dụ như khơng cần phiên mã, khiến cho protein được biểu hiện nhanh chĩng sau khi chuyển nạp. Ngồi ra, RNA ở lại tế bào chất mà khơng vào nhân tế bào, khiến cho hiệu suất biểu hiện được cải thiện và biểu hiện gen khơng lâu dài. Trong quy trình tạo tế bào CAR-T bằng cơng nghệ Sleeping Beauty, enzyme transposase cĩ thể được biểu hiện trong tế bào thơng qua chuyển nạp mRNA thay vì sử dụng DNA plasmid. Qua đĩ, transposase chỉ được biểu hiện trong thời gian ngắn, tránh hiện tượng biến đổi DNA chủ thể khơng đặc hiệu và loại bỏ hồn tồn nguy cơ hòa nhập thể gen.

Trong năm 2017, Monjezi và đồng tác giả đã cơng bố kết quả nghiên cứu sử dụng cơng nghệ “Sleeping Beauty” kết hợp với chuyển nạp mRNA mã hĩa SB transposase để tạo CAR-T nhắm đích thụ thể CD19 [77]. Kết quả giải trình tự trên hệ thống Illumina của nghiên cứu cho thấy hầu hết các vị trí hòa nhập của transposon đều nằm ngoài các gen liên quan đến ung thư và biểu hiện mạnh. Ngồi ra, khơng phát hiện thấy DNA của SB transposase sau khi tăng sinh tế bào. Khi thử nghiệm trên mơ hình chuột, tế bào CAR-T được tạo bởi quy trình này cho phép loại bỏ hoàn toàn các tế bào ung thư. Bên cạnh đĩ, hiệu quả chuyển gen bằng xung điện của các cấu trúc transposon dưới dạng minicircle và SB transposase dưới dạng mRNA là cao hơn nhiều lần so với khi sử dụng plasmid thơng thường (49,8% so với mức 12,8% khi sử dụng các plasmid truyền thống).

1.3.4. Tăng sinh tế bào sau chuyển gen

Các tế bào T cĩ khả năng tăng sinh mạnh là những tế bào ít bị biệt hĩa hơn. Sự tăng sinh yêu cầu các tín hiệu kích hoạt và mơi trường tăng trưởng thích hợp.

Sau khi tải nạp vi rút tạo tế bào CAR-T, tế bào thường được tăng sinh trong các chai T-flask, túi canh trường, hoặc các bioreactors. Hiện nay, cĩ nhiều lựa chọn khác nhau cho mơi trường nuơi cấy CAR-T, bao gồm hệ mơi trường RPMI-1640 bổ sung huyết thanh bị FBS truyền thống và các hệ mơi trường mới sử dụng huyết thanh người AB hoặc khơng sử dụng huyết thanh. Trong các thử nghiệm lâm sàng tế bào CAR-T cho đến nay, sự tăng sinh thường được thực hiện với thể tích tăng dần, bắt đầu từ nuơi cấy tế bào sau chuyển nạp trong các đĩa nuơi cấy, sau đĩ cấy chuyển sang các chai nuơi cấy, và tăng thể tích cho nuơi trong các túi chuyên dụng hoặc các bioreactors. Trong mơi trường nuơi cấy, bi từ gắn anti-CD3/CD28 thường

19 được sử dụng phổ biến nhất cho tăng sinh lượng lớn CAR-T (được áp dụng đối với sản phẩm Kymriah và liso-cel). Sau tăng sinh, bi từ được loại bỏ bằng nam châm [79]. Tuy nhiên, việc sử dụng bi từ cĩ nhược điểm là giá thành đắt. Tăng sinh sử dụng các tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo hiện đang được áp dụng trong thử nghiệm lâm sàng và được sử dụng cho cả cách tiếp cận tạo CAR-T bằng tải nạp vi rút và transposon-transposase kết hợp xung điện. Các tín hiệu kích thích dùng để tăng sinh tế bào T đã được tĩm tắt trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1. Phương pháp tăng sinh tế bào CAR-T

Tín hiệu Mơ tả

OKT3 (anti-CD3 clone) Cĩ thể sử dụng với kháng thể đồng kích thích kháng CD28 hoặc kích hoạt các cytokine (ví dụ: IL-2)

Anti-CD3/CD28

Vùng kháng thể mục tiêu kích hoạt kích thích đến tế bào T

Kháng thể tương tác tế bào T đặc hiệu (BiTEs) IL-2/IL-21 Cytokine gây ra sự tăng sinh của tế bào T Tế bào trình diện kháng

nguyên nhân tạo (aAPCs)

Tế bào được thiết kế để hoạt động như những APC nội sinh sẽ kích thích sự tăng sinh của tế bào T

Kích hoạt và tăng sinh tế bào CAR-T bằng kháng thể kháng CD3/CD28 đã cho thấy hoạt động chống khối u tốt hơn và khả năng tồn tại của tế bào lâu hơn. Các hạt từ này giúp tăng sinh mạnh mẽ các tế bào CAR-T [66] và cĩ thể được loại bỏ bằng lực từ của nam châm. Hơn nữa, các hạt từ tính phủ kháng thể kháng CD3/CD28 cĩ thể tạo ra các tế bào T ít biệt hĩa hơn, cĩ khả năng ít già hơn, khả năng tăng sinh được nâng cao và phản ứng chống khối u in vivo sớm hơn so với kích thích bằng OKT-3 và IL-2 liều cao [80, 81]. Trong các thử nghiệm lâm sàng gần đây, việc sản xuất Kymriah® ( Tisagenlecleucel; CTL019)[82, 83]và

Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017) được sử dụng các hạt từ tính phủ kháng thể kháng CD3/CD28 [84], trong khi việc sản xuất Yescarta ® ( Axicabtagene Ciloleucel; KTE-019) sử dụng kháng thể kháng CD3 với IL-2 [78].

20 Một sản phẩm nanomatrix ( T Cell TransAct ™) kết hợp với CD3 và CD28 tái tổ hợp và mơi trường khơng chứa huyết thanh (TexMACS ™) được sử dụng để kích hoạt tế bào trong quá trình sản xuất tế bào CAR-T [85]. Chiến lược kích hoạt này hỗ trợ sự tăng sinh của các tế bào T CD4+ với tỷ lệ CD4: CD8 trung bình là 2: 1 và cũng dẫn đến hoạt động phân giải tế bào thấp hơn khi so sánh với sự kích hoạt với chất kháng CD3/CD28 [85].

Tương tự, sự tăng sinh của tế bào CAR-T bằng tế bào trình diện kháng nguyên (APC) hoặc tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (aAPC) cũng tạo ra một lượng lớn các tế bào T cĩ khả năng nhân rộng in vivo sau đĩ [86]. Từ đĩ, tế bào K562 đã được biến đổi gen trong nhiều nghiên cứu khác nhau để đồng biểu hiện các phân tử kích thích và kháng nguyên khối u [85]. Khi được chiếu xạ, tế bào K562 này cĩ thể được sử dụng để tăng sinh số lượng lớn các tế bào CAR-T. Ưu điểm của sử dụng dịng tế bào K562 là khơng cĩ sự biểu hiện của các phân tử HLA-A hoặc HLA-B và cĩ thể sản xuất tuân thủ theo quy trình thực hành sản xuất tốt (GMP) cĩ sẵn [85].

Nhĩm nghiên cứu của TS. Cooper tại Đại học Texas, Mỹ đã cơng bố kết quả thử nghiệm pha I của tế bào CAR-T được chế tạo bằng cơng nghệ “Sleeping Beauty” [87]. Cấu trúc CAR được sử dụng trong nghiên cứu này là CD19RCD28 được chèn vào plasmid “Sleeping Beauty” để chuyển nạp vào 2108 tế bào PBMC bằng thiết bị Nucleofector II cùng với plasmid mã hĩa cho SB transposase. Các tế bào T sau chuyển nạp được nuơi cấy trong mơi trường được bổ sung IL-2, IL-21 với sự cĩ mặt của tế bào trình diện kháng nguyên nhân tạo (artificial antigen presenting cell hay aAPC) là tế bào K562 biểu hiện đồng thời CD19, CD64, CD86 và CD137. Sau 28 ngày nuơi cấy, lượng tế bào T được tăng sinh khoảng hơn 2000 lần, trong đĩ 84% cĩ biểu hiện cấu trúc CAR, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu về liều sử dụng trong điều trị. Giải trình tự bằng hệ thống Illumina (7,5 triệu trình tự thơ) cho thấy 99,9% các vị trí hòa nhập của cấu trúc “Sleeping Beauty” là vào các vị trí dinucleotide TA và rải đều trên toàn bộ thể gen. Hầu hết các vị trí chèn vào thể gen rơi vào vùng khơng mã hĩa, do vậy nguy cơ gây đột biến phát sinh ung thư là rất thấp. Khi kết hợp cùng với cấy ghép tế bào gốc tạo máu, sau 30 tháng theo dõi, 83% các bệnh nhân tự ghép đã thuyên giảm hoàn toàn. Điều đặc biệt là toàn bộ các bệnh nhân tự ghép đều còn sống, cho thấy tính an toàn của liệu pháp tự ghép. Tính

21 trung bình, tế bào CAR-T tồn tại trong các bệnh nhân tự ghép trong 201 ngày. Bên cạnh đĩ, nhĩm nghiên cứu của TS. Cooper còn sử dụng cơng nghệ “Sleeping Beauty” để đồng biểu hiện IL-15 cùng với cấu trúc CAR CD19RCD28 [64]. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đồng biểu hiện IL-15 giúp tế bào CAR-T cĩ thể tồn tại lâu hơn với kiểu hình tương tự như các tế bào gốc memory. Đặc biệt các thử nghiệm tiền lâm sàng trên chuột cho thấy các tế bào CAR-T CD19RCD28 đồng biểu hiện IL-15 cĩ thể được sử dụng chỉ sau 2 ngày nuơi cấy (thay vì 28 ngày để