Khi phân tích các cơng trình nghiên cứu và các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng tế bào CAR-T để điều trị ALL, cĩ thể nhận thấy là hầu hết đều sử dụng cấu trúc CAR-T hướng đích là thụ thể CD19. Các cấu trúc CAR-T cho hiệu quả điều trị ALL cao nhất trong các thử nghiệm lâm sàng đều thuộc thế hệ thứ hai sử dụng các phân tử đồng kích thích CD28 và CD137 trong đĩ CD137 cho phép tế bào CAR-T tồn tại lâu hơn trong cơ thể (đến 180 ngày trong tế bào chuột). Về các kỹ thuật chuyển cấu trúc di truyền CAR vào tế bào T, hiện cĩ 2 cách tiếp cận chủ yếu là: (i) sử dụng vectơ vi rút và (ii) sử dụng cơng nghệ Sleeping beauty. Ưu điểm chủ yếu của việc sử dụng vectơ vi rút là hiệu quả tải nạp rất cao. Tuy nhiên, quy trình sản xuất vectơ vi rút đạt tiêu chuẩn GMP là rất phức tạp với giá thành cao; trong khi đĩ, cơng nghệ Sleeping beauty lại sử dụng các plasmid vốn cĩ thể được thu nhận dễ dàng từ E. coli. Để tăng tính an toàn của cách tiếp cận Sleeping beauty tạo tế bào CAR-T, mRNA mã hĩa SB transposase được sử dụng thay thế plasmid mang gen mã hĩa SB transposase truyền thống. Một cách tiếp cận khác là đồng biểu hiện IL-15 cùng với cấu trúc CAR-T cũng sẽ giúp tế bào CAR-T tăng sinh tốt và tồn tại lâu hơn trong cơ thể. Để đảm bảo tính an toàn của liệu pháp CAR-T, cần cĩ một giải pháp để kiểm soát sự tăng sinh của tế bào CAR-T trong cơ thể. Các cấu trúc iCasp9 hiện đang được ưa chuộng do khả năng tác động rất nhanh của
25 AP20187, giúp diệt ngay các tế bào CAR-T trong các trường hợp quá mẫn cảm với các hiệu ứng phụ khi điều trị bằng tế bào CAR-T.
Với những phân tích ở trên, đề tài này cũng được tích hợp những điểm ưu việt nhất của những nghiên cứu đã cơng bố về lĩnh vực CAR-T hướng đích CD19. Đầu tiên, việc chuyển cấu trúc di truyền vào tế bào T sẽ được thực hiện bằng cơng nghệ Sleeping beauty nhằm đơn giản hĩa quy trình sản xuất, giảm giá thành. Các kết quả nghiên cứu của TS. Cooper và cộng sự từ Đại học Texas đã chứng minh tính khả thi của liệu pháp CAR-T sử dụng cơng nghệ Sleeping beauty để chuyển cấu trúc CAR vào tế bào T. Cấu trúc Sleeping beauty CAR-T sẽ cĩ dạng CD19RCD137 thay vì CD19RCD28 do CD137 đã được chứng minh là ưu việt hơn so với CD28 về khả năng giúp tế bào CAR-T tồn tại lâu hơn trong cơ thể. Ba điểm mới khác so với các nghiên cứu của của TS. Cooper và cộng sự là: (i) cấu trúc biểu hiện CAR-T thế hệ thứ tư được tích hợp trên cùng một plasmid duy nhất giúp đơn giản hĩa quy trình chế tạo cũng như đảm bảo khả năng kiểm sốt hiệu quả sự tăng sinh của tế bào CAR-T sau này; (ii) sử dụng mRNA mã hĩa SB transposase thay vì plasmid mang gen mã hĩa SB transposase để đảm bảo tính ổn định của cấu trúc CAR-T; (iii) sử dụng cấu trúc iCasp9 để kiểm soát sự tăng sinh của tế bào CAR-T trong cơ thể, đảm bảo tính an toàn của liệu pháp điều trị.
Theo sự hiểu biết của chúng tơi, cho đến nay, chưa cĩ cơng bố nào trên thế giới thiết kế biểu hiện CD19RCD137 và iCasp9/IL-15 trên cùng một plasmid duy nhất và kết hợp với mRNA mã hĩa SB transposase cho quá trình chuyển nạp. Với chiến lược biểu hiện như vậy, chúng ta sẽ cĩ một quy trình sản xuất được đơn giản hĩa, phù hợp với trình độ khoa học cơng nghệ tại nước ta hiện nay nhưng vẫn đảm bảo hiệu năng cũng như tính an toàn của liệu pháp.
26
CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất
2.1.1. Các dòng tế bào
Dòng tế bào K562 nguyên bản, Daudi được cung cấp bởi khoa Sinh lý bệnh, Học viện Quân Y 103. Tế bào aAPC 1D2 (CD19+) là kết quả của đề tài “Tạo dịng tế bào K562 trình diện kháng nguyên nhân tạo cho liệu pháp miễn dịch CAR-T hướng đích CD19”. Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được tách từ các mẫu máu được hiến tặng bởi các tình nguyên viên khỏe mạnh.
2.1.2. Hóa chất
- Chủng vi sinh vật: Chủng E. coli DH10b.
- Hệ vector: vector pJET1.2 (Thermo Fisher Scientific); vector pSB (cung cấp bởi phịng thí nghiệm Kỹ thuật gen 306-B1, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Thực phẩm, ĐH Bách Khoa Hà Nội).
- mRNA SB100X được phiên mã in vitro từ plasmid pSB100X tại phịng thí nghiệm Kỹ thuật gen 306-B1.
- Các kit tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), kit tinh sạch trên gel sản phẩm PCR QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen), kit tách chiết plasmid QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
- Hĩa chất điện di: Agarose, Tris-base, acid acetic, EDTA, High Ranger 1kb DNA Ladder (Norgen), PCR Sizer 100 bp DNA Ladder (Norgen)…
- Hĩa chất cho nuơi cấy vi sinh: tryptone, cao nấm men, NaCl, agar, ampiciline - Enzyme: Pfu DNA polymerase, Taq DNA polymerase, RNase, T4 DNA ligase, enzyme giới hạn (NEB), …
- Ficoll-Paque PREMIUM (Thermo Fisher Scientific).
- Bi từ Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific); - Phosphate-buffered saline (Sigma-Aldrich).
- Bovine Serum Albumin (Sigma-Aldrich).
27 - Trypan Blue Solution (Thermo Fisher Scientific).
- RPMI 1640 Medium (ThermoFisher Scientific). - Blasticidin S HCl (ThermoFisher Scientific). - Puromycin (ThermoFisher Scientific).
- Kit 7-AAD/CFSE Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Kit (Cayman Chemical). - Các bộ sinh phẩm IL-2 Human ELISA Kit, TNF alpha Human ELISA Kit, IFN gamma Human ELISA Kit (Thermo Fisher Scientific).
- Các vật tư tiêu hao cần thiết phục vụ cho nuơi cấy tế bào: Chai nuơi cấy tế bào, pipet, chai đựng mơi trường, lọc vi khuẩn 0,2 µm.
2.1.3. Oligonucleotide
Các trình tự oligonucleotide để tổng hợp hai cấu trúc gen nhân tạo được trình bày ở Phụ lục 3 và 4. Các trình tự oligonucleotide để khuếch đại, sàng lọc và giải trình tự các cấu trúc được trình bày ở Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Trình tự các oligonucleotide để khuếch đại, sàng lọc và giải trình tự các cấu trúc
STT Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích sử
dụng
1 NcoI-car19-F TTTCCATGGCCTTACCAGTGAC Khuếch đại cấu trúc, sàng lọc cấu trúc 2 XbaI-car19-R TTTTCTAGAGATCCAGACATGATAAG Khuếch đại cấu trúc,
sàng lọc cấu trúc
3 Car19-967-F CTCCTGTCACTGGTTATCAC Giải trình tự
4 Car19-113015-R GCAGTAAAGGGTGATAACCAGTG Giải trình tự (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5 PmlI-PGK-F GTGATATCGGATTCCCACGG Khuếch đại cấu trúc
6 icasp9-F TTTCCATGGTCGAGGGAGTGCAGGT Sàng lọc cấu trúc
7 icasp9-R TTTTCTAGACTATTAGTCGAGTGCGTAGT
CTGGTACGTCATACG
Sàng lọc cấu trúc, giải trình tự 8 IL15-F ATAGGTCTCTGGATCCGGTGAGGGCAGA Sàng lọc cấu trúc
9 IL15-R GGTCTCTTGCCCAGGTGGTGAGAACAAT
TCTCCAG Sàng lọc cấu trúc
10 IL15-179-R CACTTCATGGCGGTCAC Giải trình tự 11 IL15-P2A-R CAGGTGGTGAGAACAATTCTCCAG Giải trình tự 12 IL15-647-F CCGGCACCTCTTCTCTGAC Giải trình tự 13 EcoRI-Blasti-R AGTGAATTCACGACAGGC Khuếch đại cấu trúc
28
2.1.4. Thiết bị
- Máy chu kỳ nhiệt 96 mẫu (Eppendorf, Đức); - Máy soi chụp ảnh gel (Gensnap, Mỹ);
- Bộ điện di DNA Horrizontal mini (CBS Scientific, Mỹ); - Máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, Mỹ); - Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Bản);
- Cân phân tích CPA 324S (Satorius, Đức); - Tủ cấy vơ trùng Class II Type A2 (ESCO); - Máy lắc ổn nhiệt DTU-2C (Taitec, Nhật Bản); -Máy lắc ổn nhiệt (eppendorf, Mỹ);
-Máy ly tâm (Eppendorf, CHLB Đức); -Lị vi sĩng (Samsung);
-Tủ lạnh (0 – 4ºC) (Toshiba, Nhật);
-Tủ lạnh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, Mỹ); -Tủ lạnh sâu -20ºC và -80ºC (Sanyo);
-Máy vortex (Rotolab, OSI);
-Micropipette các loại Gilson (Pháp) và Biohit (Phần Lan); - Kính hiển vi đảo ngược kèm camera (Nikon eclipse Ti2); - Tủ ấm CO2 (Memmerk);
- Máy đếm sống chết Countess™ II Automated Cell Counter (Countess II FL); - Flow cytometer BD FACSLyric (BD Bioscience);
- Máy 4D-Nucleofector™ Core Unit (Lonza); - Hệ thống ELISA (Biotek);
- Một số thiết bị thơng thường khác được trang bị ở phịng thí nghiệm.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng đích CD19
29 Hai cấu trúc gen nhân tạo là cấu trúc CD19RCD137 và PGK-IL15-P2A- iCasp9-T2A-Blas (iCasp9-IL15) được thiết kế nằm ở hai vùng khác nhau trên vector biểu hiện pSB (Hình 2.1). Các đoạn gen được xây dựng với các promoter lần lượt là EF1α promoter và PGK promoter, đây là các promoter mạnh và cĩ khả năng hoạt động tốt trong tế bào T.
Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của vector pSB
Cấu trúc CAR nhận biết đặc hiệu CD19 với vùng đồng kích thích CD137 (CD19RCD137) được thiết kế chèn vào vùng promoter EF1α và terminator bGH (Bovine growth hormone) polyA tại hai điểm cắt là NcoI và XbaI.
Cấu trúc PGK-IL15-P2A-iCasp9-T2A-Blas (iCasp9-IL15) được thiết kế cĩ trình tự promoter là PGK, trong khi terminator là β-globin polyA đã cĩ sẵn trên vector pSB và được chèn vào vị trí tại hai điểm cắt của PmlI và EcoRI. Các hợp phần của cấu trúc này bao gồm: (i) promotor là PGK; (ii) IL15 được biểu hiện trong tế bào CAR-T sẽ giúp tế bào tăng sinh tốt và tồn tại lâu hơn trong cơ thể; (iii) iCasp9 để kiểm soát sự tăng sinh của tế bào CAR-T trong cơ thể, đảm bảo tính an toàn của liệu pháp điều trị; (iv) Blas là trình tự gen mã hĩa cho Blasticidin S deaminase, giúp tế bào kháng blasticidin; (v) P2A, T2A là trình tự các gen mã hĩa các peptide thuộc họ peptide 2A cho phép biểu hiện đồng thời nhiều protein với cùng một promotor.
30 Chiến lược tạo cấu trúc CD19RCD137/pSB (cấu trúc tạo tế bào CAR-T thế hệ thứ hai) và CAR19-iCasp9-IL15/pSB (cấu trúc tạo tế bào CAR-T thế hệ thứ tư) được trình bày trong Hình 2.2.
Hình 2.2 Chiến lược thiết kế và xây dựng các cấu trúc CAR-T hướng đích CD19 b, Phương pháp tổng hợp gen mã hóa hai cấu trúc CD19RCD137 và iCasp9- IL15 bằng gapless PCR
Trình tự gen cấu trúc CD19RCD137 và cấu trúc iCasp9-IL15 cần tổng hợp được “phân cắt” thành các oligonucleotide xếp chồng lên nhau bằng phần mềm DNAWorks (v3.2.4) (các trình tự oligonucleotide được trình bày trong Phụ lục 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
31 và 4). Nhiệt độ của vùng xếp chồng được cố định là 62 ºC với chế độ “No gaps in assembly”. Sau khi tổng hợp hĩa học, các oligonucleotide được pha thành hỗn hợp cĩ nồng độ là 1 µM mỗi loại. Hỗn hợp oligonucleotide này được sử dụng như là khuơn (nồng độ cuối cùng 0,2 µM mỗi loại) trong phản ứng PCR.
Hình 2.3 Sơ đồ nguyên tắc phương pháp tổng hợp gen gapless PCR
Quá trình tổng hợp gen các cấu trúc gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: overlap PCR
Bản chất là phản ứng PCR tự mồi. Đoạn gen mục tiêu được tổng hợp từ các cặp oligo được trộn với nhau để cĩ nồng độ mỗi oligo cuối cùng là 0,2 μM. Phản ứng overlap PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: biến tính chung ở 95ºC/1 phút, biến tính trong mỗi chu kỳ ở 95ºC/20 giây, các đoạn oligo bắt cặp ở 60ºC/30 giây, kéo dài ở 72ºC/2 phút, thực hiện 25 chu kỳ, cuối cùng 72ºC/5 phút. Sản phẩm PCR overlap giai đoạn 1 được sử dụng làm khuơn cho phản ứng full length PCR tạo gen mục tiêu.
Giai đoạn 2: full length PCR
Là giai đoạn nhân gen bằng kỹ thuật PCR thơng thường với khuơn là sản phẩm PCR của giai đoạn 1, mồi là 2 oligo ở ngồi cùng của đoạn gen. Chu trình nhiệt của giai đoạn này như sau: Biến tính chung ở 95ºC/3 phút, biến tính trong mỗi chu kỳ ở 95ºC/30 giây, nhiệt độ bắt cặp mồi được tối ưu ở 60ºC /30 giây, kéo dài ở 72ºC/2 phút, thực hiện 30 chu kỳ. Cuối cùng 72ºC/5 phút.
32
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng overlap PCR
Thành phần Thể tích (μl)
10X Buffer Pfu 5
2,5 mM dNTPs 4
Hỗn hợp oligo (20 µM mỗi loại) 1
Pfu DNA polymerase (2 U/µl) 1
Nước 39
Tổng thể tích 50
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng full length PCR
Thành phần Thể tích (μl)
10X Buffer Pfu 10
2,5 mM dNTPs 8
Mồi xuơi và mồi ngược (10 µM) 5
Sản phẩm overlap PCR 4
Pfu DNA polymerase (2 U/µl) 2
Nước 71
Tổng thể tích 100
c, Phương pháp tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch trực tiếp bằng bộ sinh phẩm QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR sau khi được bổ sung CH3COOH pH 5,2 (nồng độ cuối 0,3 M) và đệm gắn (tỉ lệ 5:1) được vortex và đưa lên cột với thể tích 600 μl/lần. Sau khi ly tâm 12000 vịng/phút, 1 phút, tồn bộ dịch qua cột được loại bỏ. Tiếp theo, 600 μl đệm rửa được đưa lên cột, ủ ở nhiệt độ phịng trong 2 phút rồi ly tâm loại dịch ở tốc độ 12000 vịng/phút trong 1 phút. Bước rửa trên được lặp lại trước khi ly tâm ở tốc độ 14000 vịng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa. DNA được rửa giải trong 60 μl đệm rửa giải.
d, Phương pháp tinh sạch trên gel sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch trên gel bằng bộ sinh phẩm QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được
33 điện di trên gel 1% agarose trước khi mảnh gel chứa đoạn gen mong muốn được cắt và chuyển vào ống eppendorf 1,5 ml sạch. Sau đĩ, 300 µl đệm gắn được bổ sung với mỗi 100 mg gel và ống được ủ tại 50-60oC trong 10 phút. Sau đĩ, CH3COOH pH 5,2 được bổ sung để đạt nồng độ cuối là 0,3 M. Sau khi đảo trộn đều, hỗn dịch trên được đưa lên cột với thể tích tối đa 600 μl/lần. Các bước tiếp theo được thực hiện tương tự như mục 2.2.1c. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
e, Phương pháp cắt sản phẩm PCR và mở vịng vector bằng enzyme giới hạn
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch và vector được cắt bằng enzyme giới hạn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR và vector
Thành phần Vector (1 µg) Sản phẩm PCR (0,2 µg) 10X FastDigest Buffer 2 μl 3 μl DNA 2 μl 10 μl Enzyme giới hạn 1 μl + 1 μl 1 μl + 1 μl Nước 14 μl 15 μl Tổng thể tích 20 μl 30 μl
f, Phương pháp nối sản phẩm cắt vào vector đã cắt mở vịng
DNA được nối vào vector biểu hiện dựa vào sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase ở 22oC trong 1 giờ. Thành phần của phản ứng được trình bày ở Bảng 2.5.
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector biểu hiện
Thành phần Thể tích (µl)
Đệm T4 10X 2
Vector pSB đã cắt mở vòng (50 ng/μl) 2 Sản phẩm PCR sau khi cắt (100 ng/μl) 2
Enzyme T4 DNA Ligase 0,5
Nước 13,5
Tổng thể tích 20
g, Phương pháp biến nạp bằng kỹ thuật sốc nhiệt
Chủng tế bào khả biến E. coli DH10b sau khi được lấy ra khỏi tủ -80ºC được làm tan đá từ từ trên đá lạnh trong 30 phút. Sau đĩ, 8 μl sản phẩm nối được thêm vào 100 μl tế bào khả biến, đảo trộn nhẹ nhàng rồi ủ trong đá lạnh 30 phút. Tiếp
34 theo, tiến hành sốc nhiệt ở 42ºC trong 15 giây và ủ đá trong 5 phút. Tế bào được nuơi phục hồi với 900 μl mơi trường LB lỏng (37oC, 1 giờ, 220 vịng/phút). Cuối cùng, dịch nuơi được trải lên đĩa thạch LB chứa ampicillin và được nuơi qua đêm ở 37ºC.
h, Phương pháp sàng lọc dịng biến nạp bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc
Các dịng khuẩn lạc sau khi biến nạp được đánh dấu và nhúng vào 50 µl TE1X trước khi được đun nĩng ở 95oC trong 10 phút. DNA khuẩn lạc sau đĩ được làm khuơn cho phản ứng PCR. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở Bảng 2.6 và Bảng 2.7.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR sàng lọc gen mục tiêu
Thành phần Thể tích (μl)
10X DreamTaq buffer 2
2,5 mM dNTPs 2
10 μM mồi xuơi 0,2
10 μM mồi ngược 0,2
Taq DNA polymerase (2 U/μl) 0,4 DNA (tách chiết từ khuẩn lạc) 2
Nước 13,2
Tổng thể tích 20
Bảng 2.7. Bảng chu trình nhiệt của phản ứng PCR sàng lọc
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95oC 3 phút 1 95oC 30 giây 30 57oC 30 giây 72oC 2 phút 72oC 1 phút 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm PCR sau đĩ được điện di trên gel agarose 1,5%. Chọn khuẩn lạc tương ứng cĩ kết quả sàng lọc đạt yêu cầu cấy chuyển vào ống falcon 50mL chứa 20 mL mơi trường LB lỏng cĩ bổ sung Amp (100 µg/ml), nuơi ở 37ºC, lắc 120 vòng/phút, qua đêm để thu plasmid.
35
i, Phương pháp tách chiết plasmid
Plasmid được tách chiết từ dịch nuơi cấy bằng bộ kit QIAGEN Plasmid Mini