Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme histone deacetylases (HDAC)

(HDAC) trên dòng tế bào MCF7

- Tế bào ung thư vú của người MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Thu tế bào và đưa tế bào ra đĩa thí nghiệm, để qua đêm cho tế bào ổn định và đạt độ bám khoảng 80% bề mặt giếng.

- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Một giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào và 10l DMSO sẽ được sử dụng làm đối chứng âm. Ủ mẫu trong 24h.

- Loại bỏ dịch nổi môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng dung dịch PBS. Thu tế bào và sử dụng bộ KIT Nuclear/Cytosol Fractionnation của hãng Biovision để thu được nuclear extract (các bước tiến hành được thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất). Bảo quản mẫu ở - 80oC trước khi tiến hành các bước phân tích xác định hoạt tính HDAC.

- Việc xác định khả năng ức chế hoạt tính enzyme histone deacetylases được thực hiện dựa trên bộ KIT Colorimetric HDAC Activity assay (BioVision). Với các thành phần bao gồm: HDAC Substrate [Boc-Lys(Ac)-pNA, 10 mM], 10X HDAC Assay Buffer, Lysine Developer, HDAC Inhibitor (Trichostatin A, 1 mM), HeLa Nuclear Extract, Deacetylated Standard (Boc-Lys-pNA, 10 mM). Cụ thể là:

+ Pha MCF-7 nuclear extract đã được xử lí mẫu trong nước để đạt tới thể tích cuối cùng là 85l và 85l mẫu đối chứng âm có enzyme HDAC nuclear extract

của tế bào MCF-7 không được xử lí mẫu cũng được tiến hành song song để so sánh khả năng ức chế HDAC của mẫu thử. Mẫu đối chứng trắng chỉ cho 85 l nước. Đối với các giếng đối chứng dương chuẩn của KIT pha 10l Hela nuclear extract với 75

l nước, với các giếng đối chứng âm chuẩn của KIT pha mẫu với 83 l nước và thêm 2 l SAHA (chất ức chế HDAC) được sử dụng như một giếng không có hoạt tính HDAC.

+ Thêm 10 l 10X HDAC Assay Buffer vào mỗi giếng.

+ Thêm 5 l HDAC Substrate vào các giếng và trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h hoặc lâu hơn nếu cần thiết.

+ Dừng phản ứng bằng việc cho thêm 10 l Lysine Developer, trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37o

C trong 30 phút.

+ Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng 400 - 405 nm.

+ Khả năng ức chế enzyme histon deacetylases (HDAC) được tính theo công thức:

OD (chất thử) *100 % ức chế hoạt tính HDAC = 100% -

OD (đối chứng âm)

Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym HDAC được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.