(HDAC) trên dòng tế bào MCF7
- Tế bào ung thư vú của người MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Thu tế bào và đưa tế bào ra đĩa thí nghiệm, để qua đêm cho tế bào ổn định và đạt độ bám khoảng 80% bề
mặt giếng.
- Chất thử (10 µl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Một giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào và 10µl DMSO sẽ được sử dụng làm đối chứng âm. Ủ mẫu trong 24h.
- Loại bỏ dịch nổi môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng dung dịch PBS. Thu tế bào và sử dụng bộ KIT Nuclear/Cytosol Fractionnation của hãng Biovision
để thu được nuclear extract (các bước tiến hành được thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất). Bảo quản mẫu ở - 80oC trước khi tiến hành các bước phân tích xác định hoạt tính HDAC.
- Việc xác định khả năng ức chế hoạt tính enzyme histone deacetylases được thực hiện dựa trên bộ KIT Colorimetric HDAC Activity assay (BioVision). Với các thành phần bao gồm: HDAC Substrate [Boc-Lys(Ac)-pNA, 10 mM], 10X HDAC Assay Buffer, Lysine Developer, HDAC Inhibitor (Trichostatin A, 1 mM), HeLa Nuclear Extract, Deacetylated Standard (Boc-Lys-pNA, 10 mM). Cụ thể là:
+ Pha MCF-7 nuclear extract đã được xử lí mẫu trong nước để đạt tới thể tích cuối cùng là 85µl và 85µl mẫu đối chứng âm có enzyme HDAC nuclear extract
của tế bào MCF-7 không được xử lí mẫu cũng được tiến hành song song để so sánh khả năng ức chế HDAC của mẫu thử. Mẫu đối chứng trắng chỉ cho 85 µl nước. Đối với các giếng đối chứng dương chuẩn của KIT pha 10µl Hela nuclear extract với 75
µl nước, với các giếng đối chứng âm chuẩn của KIT pha mẫu với 83 µl nước và thêm 2 µl SAHA (chất ức chế HDAC) được sử dụng như một giếng không có hoạt tính HDAC.
+ Thêm 10 µl 10X HDAC Assay Buffer vào mỗi giếng.
+ Thêm 5 µl HDAC Substrate vào các giếng và trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h hoặc lâu hơn nếu cần thiết.
+ Dừng phản ứng bằng việc cho thêm 10 µl Lysine Developer, trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37oC trong 30 phút.
+ Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng 400 - 405 nm.
+ Khả năng ức chế enzyme histon deacetylases (HDAC) được tính theo công thức:
OD (chất thử) *100 % ức chế hoạt tính HDAC = 100% -
OD (đối chứng âm)
Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym HDAC được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.