Các HDACi có thể tác động đến nhiều giai đoạn của chu trình tế bào và theo các con đường khác nhau như: gây ức chế tăng trưởng tế bào, gây chết tế bào thực và tế bào giảm phân hoặc ức chế hình thành mạch [111].
Hình 12: Cấu trúc chung của các chất ức chế HDACi
Cấu trúc HDACi đều có có đặc điểm cấu trúc chung gồm:
Phần 1: Nhóm liên kết với Zn2+ (ZBG): Thường là các gốc hydroxamat và có vai trò quyết định tính đặc hiệu của HDACi.
Phần 2: Nhóm liên kết (CU): là phần cầu nối giữa ZBG và CAP, thường là các nhóm hydrocacbon thân dầu.
Phần 3: Nhóm nhận diện bề mặt (CAP): thường là vòng thơm và nhóm này nằm trên bề mặt enzym nên cũng quyết định tính đặc hiệu HDACi.
Dựa trên cấu trúc chung của chất ức chế HDAC, các chất ức chế HDAC được thiết kế dựa trên cấu trúc vị trí xúc tác của HDAC. Trong đó các axit hydroxamic ức chế HDAC vẫn đang được nghiên cứu dựa trên phiên mẫu của TSA,
SAHA và các axit hydroxamic đã được tìm ra trước đó nhằm tìm ra sự liên quan về cấu trúc tác dụng của các dẫn chất này để phục vụ nghiên cứu và thiết kế tổng hợp các thuốc điều trị ung thư. Dựa vào cấu trúc HDACi đã được xác định, các HDACi mới được thiết kế theo 3 hướng khác nhau:
- Thay đổi nhóm liên kết Zn2+ - Thay đổi cầu nối
- Thay đổi nhóm nhận diện bề mặt - Thay đổi nhóm liên kết với Zn2+
Theo định hướng thiết kế như vậy, một số cấu trúc các chất ức chế HDAC có cấu trúc là xuất dựa trên bộ khung SAHA (54), hay khung ω -alkoxy của SAHA (55) hay các amit ngược của SAHA (56) (Hình 13).
CHƯƠNG 2
THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thiết bị, dụng cụ dùng trong tổng hợp
- Máy khuấy từ gia nhiệt Heidolph MR Hei-Standard của Đức. - Máy cất quay chân không IKA RV 06.2 của Đức.
- Bơm chân không Buchi Vac V-500 của Thuỵ Sỹ. - Bếp đun bình cầu Trung Quốc.
- Dụng cụ thuỷ tinh: bình cầu 3 cổ các loại, sinh hàn, cột vigreux, phễu nhỏ giọt, phễu các loại, ống đong, cốc các loại, pipette...
- Cân điện tử 10-3 Ohaus Explorer Pro EP613C (610g/1mg). - Cân kỹ thuật 10-2 Ohaus Explorer Pro EP4102C (4100g/0.01g). - Tủ hút khí độc Việt Nam
- Các hoá chất dùng trong tổng hợp đều được mua từ hãng Merck-Đức, dung môi từ Trung Quốc được cất qua cột vigreux trước khi sử dụng.
2.2. Hóa chất dùng trong thực nghiệm
TT Tên hóa chất 1 Artemisinin 2 Dihydroartemisinin 3 NaBH4 4 DMAP 5 EDC 6 4-aminobenzoic acid 7 3-aminobenzoic acid 8 Phenylpiperazin 9 Diethylamine 10 Piperidin 11 4-Methylpiperidin 12 2-Methylpiperidin 13 Morpholin 14 Pyrrolidin 15 4-Ethylpiperazin 33 TT Tên hóa chất
16 4-Methylpiperazin 17 4,7-Dichloroquinoline 18 NaN3 19 Sodium ascorbate 20 CuSO4.5H2O 21 NaNO2 22 HCl 23 Triethylamin 24 Na2SO4 25 NaHCO3 26 CuI 27 BF3.Et2O 28 (CH3)3SiCl 29 NaI 30 Ph3P 31 Succinic anhydride 32 Glutaric anhydride 33 3,3-Dimethylglutaric anhydride 34 Maleic anhydride 35 Naphthalic anhydride 36 O-(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)hydroxylamine 37 Benzoylchloride
38 Adipic acid monomethyl ester
38 Suberic acid monomethyl ester
39 NaOH 40 Dichloromethane 41 Dichloromethane 42 Ethylacetate 42 Methanol 43 Ethanol 44 Tetrahydrofuran 45 n-Hexan
2.3. Các phương pháp sử dụng trong tổng hợp và tinh chế sản phẩm
- Sắc ký bản mỏng (SKBM) được thực hiện trên các tấm bản mỏng đế nhôm tráng Silicagel 60 F254 của hãng Merck–Đức. Hiện màu bằng đèn soi UV Camag Viewing Box 3 ở bước sóng 254nm hoặc bằng bình phun thuốc thử
H2SO4 10% và đốt nóng ở 100oC.
- Sắc ký cột sử dụng silicagel có cỡ hạt 0.040-0.063µm của hãng Merck-Đức. - Các điểm nóng chảy được xác định bằng phương pháp mao quản hở trên thiết bị Electrothermal IA 9200 Shimazu.
2.4. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc sản phẩm
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR được đo trên máy BRUKER ADVANCE-500Mz của Đức tại Phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá học -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các điều kiện đo: tần số 500MHz với phổ 1H NMR và 125MHz với phổ 13C NMR, dung môi CD3OD, CDCl3 và DMSO-d6, chất chuẩn nội TMS.
2.5. Các phương pháp tổng hợp
- Sử dụng các phản ứng hữu cơ cơ bản để tổng hợp các chất trung gian và hợp chất đích như: phản ứng thế, cộng, phản ứng Click và nhiều xúc tác cơ bản và hiện đại.
2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
2.6.1. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)*Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế *Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế
bào Vật liệu và hoá chất
- FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), SRB (Sigma)
- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad)
- Chất tham khảo: Ellipticine - Các hóa chất thông thường khác
- Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn
nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
- Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp
- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
- Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 200 µg/ml; 40 µg/ml; 8 µg/ml và 1.6 µg/ml. Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (180µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA.
- Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
- 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. - Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
- Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -
OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở cá cnồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0,4 µg/ml; 0,08 µg/ml được sử dụng như là chất đối
- DMSO 10% được sử dụng là đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. - Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi có hoạt tính tốt với IC50 ≤ 20 μg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 ≤ 5 mM. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.6.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme histone deacetylases (HDAC) trên dòng tế bào MCF7 (HDAC) trên dòng tế bào MCF7
- Tế bào ung thư vú của người MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Thu tế bào và đưa tế bào ra đĩa thí nghiệm, để qua đêm cho tế bào ổn định và đạt độ bám khoảng 80% bề
mặt giếng.
- Chất thử (10 µl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Một giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào và 10µl DMSO sẽ được sử dụng làm đối chứng âm. Ủ mẫu trong 24h.
- Loại bỏ dịch nổi môi trường nuôi cấy, rửa tế bào bằng dung dịch PBS. Thu tế bào và sử dụng bộ KIT Nuclear/Cytosol Fractionnation của hãng Biovision
để thu được nuclear extract (các bước tiến hành được thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất). Bảo quản mẫu ở - 80oC trước khi tiến hành các bước phân tích xác định hoạt tính HDAC.
- Việc xác định khả năng ức chế hoạt tính enzyme histone deacetylases được thực hiện dựa trên bộ KIT Colorimetric HDAC Activity assay (BioVision). Với các thành phần bao gồm: HDAC Substrate [Boc-Lys(Ac)-pNA, 10 mM], 10X HDAC Assay Buffer, Lysine Developer, HDAC Inhibitor (Trichostatin A, 1 mM), HeLa Nuclear Extract, Deacetylated Standard (Boc-Lys-pNA, 10 mM). Cụ thể là:
+ Pha MCF-7 nuclear extract đã được xử lí mẫu trong nước để đạt tới thể tích cuối cùng là 85µl và 85µl mẫu đối chứng âm có enzyme HDAC nuclear extract
của tế bào MCF-7 không được xử lí mẫu cũng được tiến hành song song để so sánh khả năng ức chế HDAC của mẫu thử. Mẫu đối chứng trắng chỉ cho 85 µl nước. Đối với các giếng đối chứng dương chuẩn của KIT pha 10µl Hela nuclear extract với 75
µl nước, với các giếng đối chứng âm chuẩn của KIT pha mẫu với 83 µl nước và thêm 2 µl SAHA (chất ức chế HDAC) được sử dụng như một giếng không có hoạt tính HDAC.
+ Thêm 10 µl 10X HDAC Assay Buffer vào mỗi giếng.
+ Thêm 5 µl HDAC Substrate vào các giếng và trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37oC trong 1h hoặc lâu hơn nếu cần thiết.
+ Dừng phản ứng bằng việc cho thêm 10 µl Lysine Developer, trộn kĩ. Ủ đĩa ở 37oC trong 30 phút.
+ Đọc kết quả trên máy Tecan GENios Pro microplate reader ở bước sóng 400 - 405 nm.
+ Khả năng ức chế enzyme histon deacetylases (HDAC) được tính theo công thức:
OD (chất thử) *100 % ức chế hoạt tính HDAC = 100% -
OD (đối chứng âm)
Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzym HDAC được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.7. Phương pháp mô hình docking
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1. Tổng hợp các dẫn xuất triazole của artemisinin
Quy trình chung tổng hợp chất 57a,b
4-Aminobenzoic axit hoặc 3-aminobenzoic axit (5 g; 36,50 mmol) được hòa tan trong HCl 37% (15 mL) và nước (15 mL). Hỗn hợp được làm lạnh đến O oC. NaNO2 (3,02 g; 43,80 mmol; 1,2 eq) được bổ sung vào hỗn hợp trên, dung dịch phản ứng chuyển dần màu vàng, được khuấy thêm 2 giờ. NaN3 (4,75 g; 73 mmol; 2 eq) được bổ sung từ từ vào dung dịch phản ứng trên và hỗn hợp được khuấy thêm 2 giờ, sau đó để đến nhiệt độ phòng. Tinh thể thô được lọc, rửa với nước cất và kết tinh lại trong EtOH cho 57a (5,3 g, 89 %) và 57b (5,05 g; 85 %) được dùng luôn cho bước tiếp theo.
Quy trình chung tổng hợp amit 58a–i và 59a–i
Một hỗn hợp của 4-azidobenzoic acid (57a) hoặc 3-azidobenzoic acid (57b) (500 mg; 3,06 mmol), EDC (703 mg; 3,67 mmol; 1,2 eq), DMAP (186 mg; 1,53 mmol; 0,5 eq) trong CH2Cl2 (15 mL) được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Phản ứng được theo dõi bằng TLC. Hỗn hợp phản ứng sau đó được pha loãng với CH2Cl2 (10 mL) và chiết lần lượt với H2O (3 × 15 mL), 5 % NaHCO3 (2 × 15 mL), 5 % HCl (2 × 15 mL) và rửa với H2O (2 × 10 mL). Pha hữu cơ được tách ra, làm khan bằng Na2SO4 và cô dung môi dưới áp suất giảm thu được 58a–i và 59a–i là các chất rắn được dùng luôn cho bước tiếp theo mà không cần tính chế gì thêm.
Sơ đồ 15: Tổng hợp các chất trung gian 58a-i, 59a-i;
i) NaNO2, HCl đặc, NaN3, 85–89 %; ii) EDC, DMAP, amines, CH2Cl2, nhiệt độ phòng, 2 ngày, 49–71 %.
Tổng hợp chất trung gian 60
BF3.Et2O (5 giọt) trong CH2Cl2 (5 mL) được nhỏ từ vào dung dịch dihydroartemisinin (1,00 g; 3,54 mmol, 1 đương lượng) và propargyl ancol (794 mg; 14,2 mmol, 4 đương lượng) trong CH2Cl2 (10 mL) ở 0oC. Hỗn phản ứng được làm ấm đến 25 oC và khuấy ở nhiệt độ này trong 10 giờ. Hỗn hợp sản phẩm, sau khi pha loãng bằng CH2Cl2, được rửa liên tiếp bằng dung dịch nước NaHCO3 5%, nước và nước muối. Lớp hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 và cô đặc dưới áp suất giảm cho cặn phản ứng. Tinh chế sản phẩm thô bằng sắc ký cột (0–20% EtOAc/Hex) thu được sản phẩm đồng phân β.
(3R,6R,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyl-10(prop-2-yn-1-yloxy)decahydro- 12H-3,12 epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromene (60)
Đnc 116 oC; hiệu suất 80%; 1H NMR (500 MHz, CDCl3, δ (ppm)): 5,39 (s, 1H, H-12); 4,95 (d, J = 3.5 Hz, 1H, H-10); 4,29 (d, J = 2.5 Hz, 2H); 2,65 (m, 1H); 2,40– 2,30 (m, 2H); 2,05–1,17 (m, 10H); 1,42 (s, 3H); 0,93 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,91 (d, J = 7,5 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, CDCl3, δ (ppm)): 104,1; 100,6; 88,0; 81,0; 79,7; 73,9; 54,9; 52,5; 44,3; 37,4; 36,4; 34,6; 30,6; 26,1; 24,7; 24,4; 20,3; 12,7.
Quy trình chung tổng hợp triazole 61a–i và 62a–i
Một hỗn hợp của 60 (322 mg, 1 mmol) và các azide tương ứng 58a–i và
59a–i (1,2 eq) trong MeCN (10 mL) được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Một lượng nhỏ xúc tác CuI được bổ sung vào và phản ứng được khuấy thêm 2-5 giờ. Hỗn hợp phản ứng sau đó được pha loãng với CH2Cl2 (15 mL) và chiết với H2O (2 × 10 mL). Pha hữu cơ được tách ra và làm khan bằng Na2SO4, bốc hơi dưới áp suất giảm. Các triazole 61a–i và 62a–i thu được bằng sắc ký cột silica gel hệ dung môi rửa giải CH2Cl2: MeOH: Et3N.
Sơ đồ 16: Tổng hợp các triazole sử dụng phản ứng Click
i) propargyl alcohol, BF3Et2O, 2 ngày, 82 %; ii) CuI, MeCN, nhiệt độ phòng, 3–5 giờ, 49–66 %.
Morpholino(4-(4-((((3R,6R,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-trimethyldecahydro- 3H-3,12epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10-yl)oxy)methyl)-1H-1,2,3-triazol- 1-yl)phenyl)methanone (61a)
Chất rắn màu trắng: sắc ký cột hệ dung môi CH2Cl2: MeOH: Et3N (99: 1: 0,1); 62 %. đnc 131–132 oC; IR (KBr, m (cm-1)): 1645, 1579, 1474, 1446, 1377, 1194, 1101, 1032, 982, 931, 878. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7,98 (s, 1H, H-30); 7,81 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-6´), 7.56 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-5´); 5,45 (s, 1H, H- 12); 5,03 (d, J = 12,5 Hz, 1H, H-1´); 4.99 (d, J = 3.5 Hz, 1H, H-10); 4.79 (d, J = 12.5 Hz, 1H, H-1´); 3,57 (brs, 4H, H-2´´); 3,29 (brs, 4H, H-1´´); 2,68 (m, 1H, H-9); 2,41–2,35 (tt, J = 14,0; 10, 0 Hz, 1H, H-4α); 2,07–2,02 (m, 1H, H-4β), 1.90–1.86 (m, 2H, H-8α, H-5α); 1,78 (m, 1H, H-8β); 1,64–1,59 (m, 1H, H-7β); 1,52–1,47 (m, 2H, H-8α, H-5β); 1,45 (s, 3H, H-14); 1,27–1,25 (m, 2H, H-6, H-5α); 0,95–0,91 (overlap, 7H, H-7α, H-15, H-16). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 168,8 (C=O); 145,0 (C-2´); 136,6 (C-4´); 136,4 (C-7´); 126,9 (C-6´); 119,5 (C-5´); 119,0 (C-3´); 103,2 (C-3); 100,9 (C- 10); 87,0 (C-12); 80,0 (C-12a); 64,3 (C-2´´); 60,6 (C- 1´); 52, 3 (C-1´´); 51,5 (C-5a); 43,4 (C-8a); 36,4 (C-6); 35,4 (C-4); 33,6 (C-7); 29,9 (C-9); 25,1 (C-14); 23,7 (C-5); 23,4 (C-8); 19,3 (C-15); 11,9 (C-16). ESI-HRMS: lý thuyết: C29H39N4O7: 555.28187; tìm thấy: 555.28181 [M + H]+.
N, N-Diethyl-4-(4-((((3R,6R,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9-
trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10- yl)oxy)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)benzamide (61b)
Chất rắn màu trắng: sắc ký cột hệ dung môi CH2Cl2: MeOH: Et3N (99: 1: 0.1); 59 %. đnc 145–146 oC. IR (KBr, m (cm-1)): 1655, 1570, 1471, 1440, 1371, 1193, 1106, 1030, 980, 937, 879. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7,60 (s, 1H, H-3´); 7,59 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-6´); 7,58 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-5´); 5,45 (s, 1H, H-12); 5,02 (d, J = 12,5 Hz, 1H, H-1´); 4,98 (d, J = 3,5 Hz, 1H, H-10); 4,79 (d, J = 12,5 Hz, 1H, H- 1´); 3,74 (brs, 4H, H-1´´); 2,69–2,67 (m, 1H, H-9); 2,41–2,35 (tt, J = 14,0; 10,0 Hz, 1H, H-4α); 2,07–2,02 (m, 1H, H-4β); 1,91–1,87 (m, 2H, 8α, H-5α); 1,79–1,75 (m, 1H, H-8β); 1,64–1,59 (m, 1H, H-7β); 1,52–1,47 (m, 2H, H-8α, H- 5β); 1,45 (overlap, 9H, H-14, H-2´´); 1,35–1,28 (m, 1H, H-6); 1,26–1,22 (m, 1H, H- 5α); 0,93 (overlap, 7H, H-7α, H-15, H-16). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 168,9 (C=O); 146,0 (C-2´); 137,9 (C-4´); 135,6 (C-7´); 128, 8 (C-6´); 120,6 (C-5´); 120,5 (C-3´); 104,1 (C-3); 101,8 (C-10); 87,9 (C-12); 81,1 (C-12a); 66,8 (C-1´); 61,6 (C-1´´); 52,5 (C-5a); 44,3 (C-8a); 37,3 (C-6); 36,4 (C-4); 34,5 (C-7); 30,8 (C- 9); 26,1 (C-14); 24,6 (C-5); 24,4 (C-8); 20,3 (C-15); 12,9 (C-16). ESI- HRMS: Lý thuyết: C29H41N4O6: 541.30261; tìm thấy: 541.30258 [M + H]+. (4-Methylpiperazin-1-yl)(4-(4-((((3R,6R,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9- trimethyldecahydro-3H-3,12epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen-10- yl)oxy)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)phenyl)methanone (61c) 43
Chất rắn màu trắng: sắc ký cột hệ dung môi CH2Cl2: MeOH: Et3N (98: 2: 0.1); 58 %. đnc 92–93 C. IR (KBr, v (cm-1)): 1660, 1560, 1479, 1440, 1375, 1192, 1102, 1030, 988, 932, 879. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8,08 (s, 1H, H-3 ´); 7,83 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-6´); 7,59 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-5´); 5,45 (s, 1H, H-12); 5.02 (d, J = 12,5 Hz,1H, H-1´); 4.98 (d, J = 3,5 Hz, 1H, H-10); 4,78 (d, J = 12,5 Hz, 1H, H-1´); 3,82 (brs, 4H, H-1´´), 3,48 (brs, 4H, H-2´´); 2,65 (m, 1H, H-9); 2,46– 2,41 (m, 1H, H-4α); 2,34 (m, 3H, H-3´´); 2,07–2,03 (m, 1H, H-4β); 1,91–1,86 (m, 2H, H-8α, H-5α); 1,80–1,73 (m, 1H, H-8β); 1,63–1,58 (m, 1H, H-7β); 1,52– 1,49 (m, 2H, H-8α, H-5β); 1,46 (s, 3H, H-14); 1,37–1,31 (m, 1H, H-6); 1,31–1,23 (m, 1H, H-5α); 0,92 (overlap, 7H, H-7α, H-15, H-16). 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 168,8 (C=O); 146,0 (C-2´); 137,7 (C-4´); 136,1 (C-7´); 128,7 (C-5´); 120,8 (C-6´); 120,6 (C-3´); 104,1 (C-3); 101,8 (C-10); 88,0 (C-12); 81,6 (C-12a); 61,6 (C- 1´); 53.4 (C-2´´); 53,4 (C-1´´); 52,5 (C-5a); 45,9 (C-3´´); 44,4 (C-8a); 37,4 (C-6); 36,4 (C-4); 34,5 (C-7); 31,5 (C-9); 26,1 (C-14); 24,6 (C-5); 24,3 (C-8); 20,3 (C-15); 13,0 (C-16). ESIHRMS: lý thuyết: C30H42N5O6: 568.31351; tìm thấy: 568.31309 [M + H]+.
(4-Ethylpiperazin-1-yl)(4-(4-((((3R,6R,9R,10S,12R,12aR)-3,6,9- trimethyldecahydro-3H-3,12-epoxy[1,2]dioxepino[4,3-i]isochromen- 10-yl)oxy)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)phenyl)-methanone (61d)
Chất rắn màu trắng: sắc ký cột hệ dung môi CH2Cl2: MeOH: Et3N (98: 2: 0.1); 53 %. đnc 121–122 C. IR (KBr, v (cm-1)): 1670, 1568, 1479, 1446, 1379, 1182, 1109, 1036, 989, 931, 872. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8,04 (s, 1H, H-3´); 7,83 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-6´); 7,60 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H-5´); 5,45 (s, 1H, H-