CHƯƠNG 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN LEGIONELLA
4.2.4. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuơn là một trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện tạo ra các đột biến gen, chẩn đốn bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật cĩ trong thực phẩm…
Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên nghiệp để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuơn. Mạch khuơn thường là một trình tự DNA của gen đặc trưng cho lồi vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của đoạn mạch khuơn và nhờ hoạt động của DNA polymerase được nối dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính của DNA polymerase. Khi cĩ sự hiện diện của hai mồi chuyên nghiệp bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức cĩ thể thấy sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và cĩ thể thu nhận được đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gen. Như vậy, khuếch đại một trình tự DNA xác định cần phải cĩ
những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự các base ở hai đầu đoạn đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước :
a) Bước 1 : Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C trong 30 – 60 giây. Mạch đơi DNA tách ra thành dạng mạch đơn.
b) Bước 2 : Nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn, nhiệt độ này khoảng 40 – 700C, trong khoảng 30 – 60 giây.
c) Bước 3 : Tổng hợp.
Nhiệt độ được tăng lên đến 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường 30 giây đến nhiều phút.
Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu như sau : a) Bước 1 : Tăng sinh trên mơi trường khơng hoặc ít chọn lọc trong
thời gian từ 10 – 20 giờ.
b) Bước 2 : Thu dịch nuơi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bà vi khuẩn, huyền phù tế bào TE (10Mm Tris – HCl, pH =8,0, 1Mm EDTA) với thể tích bằng 1/10 tể tích dịch ni cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 1000C trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất khơng tan ức chế phản ứng PCR.
c) Bước 3 : Thực hiện phản ứng PCR
d) Bước 4 : Điện di gel agarose 1,5% xem kết quả trên đèn UV.