12 R=H (dãy IIIa-l), CH3 (dãy IVa-l)
3.3.1.Tối ưu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu
người được đánh giá theo hai tiêu chí, một là độ đặc hiệu, hai là độ nhạy.
Độ đặc hiệu của cơ chất là khả năng phản ánh đúng
thực trạng tế bào-có esteraza phải dương tính, không có, phải âm tính.
Độ nhạy của cơ chất là giới hạn phát hiện esteraza trong tế bào bạch cầu, giới hạn phát hiện càng nhỏ thì độ nhạy càng cao. Cơ chất có độ nhạy càng cao thì điểm nhuộm càng cao.
3.3.1. Tối ưu hoá phản ứng nhuộm esteraza tế bào bạch cầu cầu
Đã tiến hành nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm esteraza đặc hiệu sử dụng cơ chất napthol AS-D cloaxetat của hãng Sigma-Aldrich theo phương pháp đơn hình. Thiết kế quy hoạch hóa thực nghiệm gồm 6 biến là nhiệt độ nhuộm (X1), hàm lượng DMF (X2), DMSO (X3), cơ chất (X4), muối điazo (X5) và pH (X6). Chọn thời gian cố định 10 phút, hệ dung môi gồm 3 cấu tử DMSO, DMF và nước. Lựa chọn mức gốc thực nghiệm thể hiện ở bảng 3.17.
Bảng 3.17: Lựa chọn mức gốc thực nghiệm (1,5ml) Nhân tố X1, T0C X2, µl X3, µl X4, mg X5, mg X6, pH Mức 37,0 4,50 4,50 0,45 0,45 7,30
gốc
i 2,0 0,750 0,75 0,15 0,15 0,30 Sau khi thực hiện các thí nghiệm tại các đỉnh đơn hình, đã thu được thông số tối ưu cho các thành phần dung dịch cơ chất nhuộm tế bào với thể tích 1,5 ml, như sau:
+ Naphtol AS-D cloaxetat: 0,480 mg.
+ Muối diazo: Fast blue BB 0,459 mg. + DMF 43,6 µl. + DMSO 44,53 µl. + Đệm photphat pH=7,42 (Sörensen) ): 1.411,87 µl.
Xử lý dữ liệu bằng chương trình thống kê SPSS 17.0, cho thấy, độ tin cậy của điểm nhuộm 95,67% ± 0,76 (p = 0,95). Kết quả nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người được thể hiện trên bảng sau:
34
Bảng kết quả điểm nhuộm của 3-(N-thế cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat