Câc phương phâp chiết rút vă tinh sạch protein đều dựa trín những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phđn tử, độ hòa tan... của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liín kết với câc phđn tử sinh học khâc nín việc chiết rút câc protein năy còn phụ thuộc văo bản chất của câc liín kết.
Muốn thu nhận được câc protein nguyín thể tức lă protein có tất cả tính chất tự nhiín đặc trưng của nó, cần sử dụng câc biện phâp khâc nhau.
2.1. Nhiệt độ
Để tâch câc protein khâc nhau dựa trín kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương phâp biến tính chọn lọc nhờ tâc dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý lă chỉ nín dùng đối với trường hợp câc protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 700C trong thời gian xâc định, sau đó protein tạp đê bị biến tính được loại bỏ bằng câch lọc hoặc ly tđm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng câch cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn câc protein tạp.
Để thu nhận chế phẩm protein theo phương phâp kết tủa thuận nghịch bằng câc muối trung tính, cần tiến hănh ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hănh ở nhiệt độ dưới 00C trânh biến tính đặc biệt lă protein enzyme.
2.2. Nồng độ proton (pH)
Protein lă câc chất lưỡng tính, vì vậy, trong câc dung dịch acid vă kiềm chúng sẽ bị phđn ly như sau:
Protein - COOH Protein - COO- + H+
Protein - NH2 Protein - NH3+
Do câc acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng câc ion hóa lă nguyín nhđn tạo ra tính đa điện của protein. Phđn tử protein rất dăi nín nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đâng kể, chủ yếu câc nhóm chức tự do khâc của chuỗi bín (R) quyết định tính chất tích điện của phđn tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, ε - NH2 của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine)
Mức độ ion hóa của câc nhóm năy phụ thuộc văo giâ trị pH. Câc nhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, câc nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường acid.
Như vậy, ở một giâ trị pH xâc định, mỗi phđn tử protein có một điện tích tổng số năo đấy mă độ lớn của nó phụ thuộc văo số lượng câc nhóm tích điện dương vă tích điện đm. Kết quả lă ở giâ trị nồng độ ion hydro cố định, câc protein khâc nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khâc nhau. Nhiều phương phâp dùng để tâch câc hỗn hợp protein đều dựa văo đặc tính năy. Câc phđn tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc đm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nín dễ tan văo dung dịch. Mỗi một protein có một giâ trị pH nhất định mă ở đó tổng số điện tích đm vă điện tích dương trong phđn tử bằng không. Giâ trị đó gọi lă điểm đẳng điện của protein. Điểm đẳng điện của câc acid amin trung tính có giâ trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với câc acid amin có tính acid (dicarboxylic) lă từ 3,0 - 3,2; đối với câc acid amin có tính kiềm (diamino) lă từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein lă thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa văo tính chất năy, người ta có thể tâch từng phần câc protein enzyme trong hỗn hợp.
Cũng giống như trường hợp tâc dụng của nhiệt độ trong việc tâch chiết protein, có thể dùng phương phâp biến tính chọn lọc nhờ tâc dụng của pH của môi trường. Dịch protein enzyme được giữ ở pH ≤ 5 trong thời gian xâc định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng câch lọc hoặc ly tđm. Ví dụ citochrom C cũng tan trong acid trichloracetic trong khi đó acid năy lăm kết tủa phần lớn protein. Như vậy câc protein bền với acid có thể được tâch chiết bằng câch năy.
Kiềm acid acid Kiềm
2.3. Tâc nhđn hóa học
Có thể dùng muối trung tính hoặc câc dung môi hữu cơ để tâch chiết câc protein enzyme. Phương phâp năy được tiến hănh dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc văo sự tương tâc của câc nhóm tích điện trong phđn tử protein với câc phđn tử nước. Sự tương tâc đó (còn gọi lă sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thím văo dung dịch protein enzyme câc dung môi hữu cơ hoặc câc muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng lă etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp câc loại rượu.
Khi sử dụng câc dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hănh ở nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hănh tâch phđn đoạn dưới 00C vă có thể đến -200C, như vậy có tâc dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme.
Khi đê có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng câch dùng mây ly tđm lạnh.
Câc muối trung tính có thể dùng lă (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiín, người ta đê nhận thấy muối (NH4)2SO4 lă tốt nhất vì nó không lăm hại mă lăm ổn định (lăm bền) hầu hết câc loại protein enzyme. Loại muối năy lại rẽ tiền vă phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bảo hòa 767g/l ở 250C)
Ngoăi ra nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khâc nhau thì khâc nhau nhiều.
Ví dụ: Protease của nấm mốc dễ bị kết tủa ở 70% của (NH4)2SO4 bảo hòa hoăn toăn, còn amilase của mầm lúa bị kết tủa ở 50% độ bảo hòa của dung dịch muối năy. Điều đó nói lín tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4
cao hơn câc muối khâc.
Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột vă dạng dung dịch bảo hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một văo dịch chiết protein enzyme. Câch cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối văo dịch chiết cần phải có mây khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Khi dùng dung dịch bảo hòa, trong nhiều sâch về phương phâp nghiín cứu, người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha câc dung dịch có độ bêo hòa khâc nhau ở những nhiệt độ nhất định.
Khâi niệm về số phần trăm của độ bảo hòa hoăn toăn đê được đề cập đến. Như ví dụ trín thì protein enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bêo hòa hoăn toăn của (NH4)2SO4. Khi cho dung dịch
(NH4)2SO4 bêo hòa văo dịch chiết protein enzyme thì nồng độ (NH4)2SO4
không tăng đột ngột. Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắng khoảng 2 giờ hoặc qua đím, mục đích lă tạo kết tủa hoăn toăn (ở phương phâp dùng dung môi hữu cơ thì không cần để lđu). Kết tủa được lấy ra bằng câch ly tđm hoặc lọc qua phễu Buchner. Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thím ion Ca++ để lăm bền protein enzyme (dùng CaCl2 hoặc Ca(CH3 COO)2
Để tiện lợi, người ta đưa ra công thức câch tính lượng (NH4)2SO4
cho văo dịch có độ bêo hòa cho trước (S1) để đạt đến một độ bêo hòa cần thiết (S2)
Tùy theo trạng thâi (NH4)2SO4 cho thím văo dịch chiết protein enzyme mă có công thức tính toân khâc nhau.
- Đối với (NH4)2SO4 ở dạng bột x(g) = 2 1 2 272 , 0 1 ) ( . 515 , 0 S S S V − −
Trong đó V lă thể tích dung dịch, S1, S2 lă độ bêo hòa cho trước vă độ bêo hòa cần đạt (ví dụ: S1 = 0,5; S2 = 0,7 chẳng hạn). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Người ta cũng có thể dùng bản đồ toân (nomogram) để chiếu vă xâc định được lượng (NH4)2SO4 thím văo để dịch chiết protein enzyme đạt được một độ bêo hòa nhất định. Hoặc có thể đối chiếu ở bảng có sẵn. Lượng (NH4)2SO4 đưa văo để dung dịch có độ bêo hòa nhất định có khâc nhau tùy theo nhiệt độ thí nghiệm.
- Đối với (NH4)2SO4 ở dạng dung dịch bêo hòa.
Thể tích (tính theo ml) của dung dịch bêo hòa cần cho văo 100ml dung dịch có độ bêo hòa ban đầu S1 để đạt đến một độ bêo hòa S2 cần thiết được tính theo công thức sau:
V(ml) = 2 1 2 1 ) .( 100 S S S − −
Như vậy, nếu thím từng phần câc dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 (có nồng độ bêo hòa khâc nhau) thì ta có thể tâch từng phần hỗn hợp protein enzyme. Tuy nhiín, để phđn chia hoăn toăn những hỗn hợp phức tạp, phương phâp năy không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lín. Mặc dầu vậy, câch kết tủa từng phần năy cũng rất có lợi, đặc biệt lă đối với giai đoạn đầu của việc tâch chiết vă lăm
sạch protein emzyme, vì phương phâp khâ đơn giản.
Ngoăi ra, câc tâc động khâc như cơ học, sóng siíu đm... có ảnh hưởng đến quâ trình tâch chiết protein emzyme.