Ở phương pháp này, một mẩu nhiễm sắc thể của một tế bào của phôi được sử dụng và
giới tính của phôi được xác định bằng việc xác định thành phần của nhiễm sắc thể giới tính. Rất may là nhiễm sắc thể của bò gồm những nhiễm sắc thể giới tính acrocentric và metacentric. Vì thế, rất dễ dàng để phân biệt giới tính của phôi bằng việc kiểm tra thành phần hình thái cùa các nhiễm sắc thể giới tính (XY hay XX) nếu các mẫu nhiễm sắc thể
được chuẩn bị tốt. các phương pháp phân tích nhiễm sắc thể được phân loại thành ba
phương pháp bởi giai đoạn phát triển của phôi hay bởi phương pháp lấy vật liệu để phân tích.
52
(1) Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể sử dụng các tế bào trophoblast của phôi 15 ngày tuổi không có màng trong suốt.
Hare và cs (1976) là những người đầu tiên sử dụng phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của các tế bào phôi để xác định giới tính của phôi. Đầu tiên, họ lấy một phần (0,5mm) phôi 14-15 ngày tuổi bằng sử dụng panh và kéo nhỏ. Sau đó, họ thu vật liệu để phân tích nhiễm sắc thể bằng việc cắt phôi 11-15 ngày tuổi (kích thước <9mm) bằng một lưỡi dao thép không gỉ. Họ đã báo cáo rằng tỷ lệ thành công của phân tích nhiễm sắc thể dao động với kích thước của phôi (Hare và cs 1978). Tỷ lệ thành công là 9,0% (n=11), 63,6% (n=55) và 68,7% (n=32) khi phôi có kích thước <0,9mm, 0,9-4mm và >4,9mm, tương ứng. Wintenberger-Torres và Popescu (1980) đã cắt rời 1/3-1/10 phôi 13 ngày tuổi bằng kéo Wecker để dùng cho phân tích nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, phương pháp này
không được áp dụng rộng rãi bởi vì phôi 7 ngày tuổi vẫn còn ở trong màng trong suốt
được dùng để cấy truyền phôi bò.
(2) Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể bằng sử dụng một phần tế bào của phôi 6-7 ngày tuổi
Ở phương pháp này, 10-20 tế bào được lấy ra khỏi phôi ở giai đoạn phôi dâu hay
phôi nang sớm bằng thao tác dưới kính hiển vi và các tế bào được sử dụng để phân tích nhiễm sắc thể.
Chỉ một số lượng nhỏ các tế bào, 10-20, được lấy ra khỏi phôi. Để lấy được ít nhất một hay hai đĩa nhân của pha giữa (metaphase) cần thiết để phân tích nhiễm sắc thể từ một mẫu, hơn 10% tế bào phải ở pha giữa. Theo Singh và Hare (1980), số tế bào trung bình ở phôi dâu 6 ngày tuổi là 50,2 và chỉ số phân bào (mitotic) trung bình là 8,9. Vì vậy, họ đã báo rằng xác định giới tính bằng việc sử dụng các tế bào lấy ra từ phôi dâu là phức tạp hơn và ít thành công hơn so với việc xác định giới tính sử dụng các tế bào trophoblast của phôi 12-15 ngày tuổi.
(3) Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể bằng việc sử dụng một nửa phôi 6-8 ngày tuổi mà phôi đó được chia đôi.
Gần đây, với sự phát triển của kỹ thuật cắt phôi, một nửa phôi được chia đôi có thể được sử dụng để phân tích nhiễm sắc thể. Nửa còn lại có thể được bảo quản trong thời gian ngắn hay đông lạnh đến khi kết quả của phân tích nhiễm sắc thể được biết. Sau khi giới tính đã được xác định, cấy phôi được thực hiện.
Giai đoạn phát triển của phôi sử dụng ở phương pháp này tương tự như ở với giai
53
một nửa số tế bào tạo nên một phôi được sử dụng như vật liệu để phân tích nhiễm sắc thể thì dễ dàng thu được đĩa nhân của pha giữa và tỷ lệ thành công của xác định giới tính là cao. Bên cạnh một số thí nghiệm sử dụng phương pháp này ở Nhật Bản, Rall và Leibo (1987) đã báo cáo những kết quả của những thí nghiệm đã sử dụng nhiều phôi. Họ nhận thấy trung bình 2,64 đĩa nhân của pha giữa trong các mẫu hay ít nhất 1 trong 84,7% tất cả các mẫu các kết quả đủ tốt để cho phép áp dụng phương pháp này cho sản xuất trong tương lai.
(4) Phương pháp tạo mẫu nhiễm sắc thể phôi
Về cơ bản, các phương pháp thực hiện cùng một kỹ thuật như khi tạo mẫu nhiễm sắc thể của các mô tế bào thông thương. Đầu tiên số lượng tế bào tăng lên do nuôi cấy trước; những sợi spindle của tế bào bị phá huỷ do sử lý bằng colchicine hay colcemid để ngăn cản nhiễm sắc thể di chuyển về phía cực tế bào trong quá trình phân chia và giữ cho sự phân chia tế bào ở pha giữa (metaphase) đến giai đoạn giữa (mid-stage); sau đó các tế bào giãn nở do sử lý bằng dung dịch hypotonic để phân tán nhiễm sắc thể trong tế bào và làm cho việc kiểm tra dễ hơn, và ở bước cuối cùng, các tế bào được đặt trên phiến kính (slide glass) cùng với chất cố định và được làm khô nhanh chóng. Sau đó, các tế bào gắn vào phiến kính có thể kéo rộng nhờ sức căng bề mặt và sau đó được nhuộm.
Để nâng cao tỷ lệ thành công về xác định giới tính bằng phương pháp này, các tế bào nên được nuôi cấy để đạt được một số lượng đĩa nhân ở pha giữa mà nhiễm sắc thể của nó dễ kiểm tra. Sau đó, các mẫu làm nhiễm sắc thể mà karyotypes cần được phân tích. Trong tương lai, thời gian cần thiết để phân biệt giới tính nên được rút ngắn và phương pháp bảo quản phôi để cấy truyền cần phải được cải tiến để nâng cao tỷ lệ sống sót của chúng.
7.1.4.2.Xác định giới tính phôi bằng các phương pháp miễn dịch Xác định giới tính phôi bằng sử dụng kháng thể H-Y
Trong các thí nghiệm ghép da có sử dụng một dòng chuột cận huyết, ghép da được chuyển từ một con chuột cùng giới tính và chuyển từ chuột đực sang chuột cái đã được chấp nhận thành công. Mặt khác, ghép da chuyển từ chuột đực sang chuột cái bị từ chối bởi vì đã gây nên phản ứng miễn dịch (Eichiward và Silmeser, 1955). Hiện tượng này dường như gây nên bởi phản ứng của gen trên nhiễm sắc thể Y, mà nhiễm sắc thể này chỉ có ở con đực (Billing và Silvers, 1960). Kháng nguyên gây nên hiện tượng này được gọi là kháng nguyên Y hoà hợp tế bào, kháng nguyên H-Y.
54
Krco và Goldberg (1976) nuôi cấy phôi chuột trong một môi trường nuôi cấy có chứa những kháng thể này và chất bổ xung. Một số tiếp tục phát triển và một số dừng phát triển. Những phôi mà tiếp tục phát triển là phôi cái, nghĩa là, những phôi không bị ảnh hưởng bởi kháng thể đực. Những phôi dừng phát trển là phôi đực (Strzeminski, 1979; Esptein và cs, 1980). Do đó, những nghiên cứu về xác định giới tính hay tách giới tính những con vật thí nghiệm đã được thúc đẩy. Các thí nghiệm xác định giới tính hay tách giới tính những phôi gia súc như bò và dê cũng đã được tiến hành.
Wachtel (1984) thực hiện xác định giới tính trên 75 phôI bò 7-11 ngày tuổi bằng phương pháp kháng nguyên huỳnh quang gián tiếp có sử dụng kháng nguyên monoclon. 34 phôi có huỳnh quang dương tính, 31 âm tính và 10 không rõ. Ngoài số này ra, 7 phôi đã được xác định giới tính đã được cấy cho 7 con nhận, 6/7 bê sinh ra đúng với giới tính đã được dự đoán trước.
White và cs (1984) đã thực hiện xác định giới tính ở phôi bò 6-7 ngày tuổi (16 tế
bào đến giai đoạn phôi nang sớm). Họ đã áp dụng phương pháp kháng nguyên huỳnh
quang gián tiếp bằng việc sử dụng kháng huyết thanh H-Y tạo ra từ chuột: Trong số 125 phôI được kiểm tra, 89% những phôi đã được xác định giới tính sẽ là đực và 30% những phôi được xác định là cái phù hợp với kết quả xác định nhiễm sắc thể giới tính.
Gần đây, White và cs (1987) đã thực hiện cấy truyền phôi theo phương pháp sau: Họ xác định giới tính của phôi bằng phương pháp kháng nguyên huỳnh quang gián tiếp và sau đó chia đôi phôi để cấy cho con nhận. Tỷ lệ sống (tỷ lệ phôi tạo ra bê thành công) của những phôi đã được xác định giới tính là 36% (n=86) và những phôi chưa được xác định giới tính là 38% (n=156). Tỷ lệ sống sót của hai nhóm phôi hầu như không có sự khác biệt nào. Hơn nữa, giới tính của 84% phôi được xác định là chính xác.
55 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tài liệu tham khảo
[1]http://ivfhungvuong.com.vn/modules.php?name=Shoping&op=display_product &pid=79&newlang=vietnamese [2] http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=3531 [3] http://yume.vn/tothinhut/article/thu-nhan-va-bao-quan-tinh-trung-tinh-trung- dong-lanh-15-nam-van-song.35D5E8C7.html) [4]http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=3847 [5] http://www.ivftudu.com.vn/article/1254/ [6]http://www.gettingpregnant.co.uk/intratubal-insemination.html [7] http://www.medic8.com/healthguide/infertility/infertility-treatment/iti.html [8] http://solutionsfromnest.wordpress.com/2011/06/03/emerging-infertility- technology-intrafollicular-insemination-ifi/ [9] http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/007279.htm [10] http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=4153