7.1.Bảo quản phôi, giao tử
7.1.1. Đông lạnh phôi
Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cực thấp (-196oC) trong nito lỏng sẽ
làm ngưng hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát
triển,... giúp lưu giữ chúng trong thời gian rất dài, mà sau khi rã đông những phôi này vẫn phát triển bình thường.
Có 2 phương pháp đông lạnh phôi:
Phương pháp làm chậm
Phương pháp làm nhanh (Phương pháp thủy tinh hóa)
Nguyên tắc chung:
Để trữ tế bào sống trong thời gian dài thì tất cả các hoạt động chức năng bên trong tế bào phải ngừng lại. Ở nhiệt độ nito lỏng (-196oC) hầu hết các phản ứng hóa học không xảy ra được. Các phân tử nước tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian như ngừng trôi đối với tế bào được trữ. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng đến tế bào trữ lạnh là bức xạ môi trường. Tuy nhiên trong thực tế, yếu tố này không quan trọng và một nghiên cứu cho thất tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi được chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi rã đông và chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào. Giai đoạn chính ảnh hưởng đến sự thành công của trữ lạnh chính là làm lạnh và rã đông.
Các bước tiến hành trong quá trình đông lạnh phôi:
Chuyển phôi
Chuyển hợp tử Chuyển phôi giai đoạn 2 tế bào đến giai đoạn morula
Chuyển phôi giai đoạn blastocys
Đặt một phôi (hợp tử tạo bên ngoài cơ thể) vào trong ống dẩn trứng thông qua kính soi ổ bụng.
Phôi sau 5-7 ngày, nuôi qua giai đoạn blastocys để thuận lợi bám vào màng nội mạc tử cung để tăng tỷ lệ mang thai
Chuyển phôi 1- 12 tế bào vào trong buồng tử cung
50 Chọn phôi: phôi được chọn trữ lạnh phải có chất lượng cao để chúng sống sót và Chọn phôi: phôi được chọn trữ lạnh phải có chất lượng cao để chúng sống sót và phát triển thai tốt trong giai đoạn giải đông. Theo Kenedy và cộng sự vào năm 1983, chất lượng phôi được xếp thành 5 mức độ khác nhau, phôi tốt nhất là phôi loại 1.
Môi trường đệm: cũng giống như môi trường nuôi cấy tế bào động vật, trong đông lạnh phôi cũng cần có dung dịch đệm. Đối với những loài động vật khác nhau thì môi trường đệm cũng khác nhau. Ví dụ: PBS chứa 20% huyết thanh bê là môi trường đệm thường được dùng cho đông lạnh phôi bò. Ở các loài động vật khác môi trường đệm hay dùng là HEPES với 10 – 15% huyết thanh bê. Ở người môi trường đệm HEPES thay thế cho hệ đệm bicarbonat và có thể thêm 0,5 -1% HAS hay 10 – 15% huyết thanh của người nhận.
Chất bảo quản: Glycerol, DMSO, ethylen glycon, polyvinyl prolydine (PVP) và sucrose thường được sử dụng bổ sung như các chất bảo vệ chống lại sự đông lạnh phôi. PVP và sucrose sẽ khử nước tự do bên trong tế bào nhưng chúng không xâm nhập vài tế bào. Trong khi đó, Glycerol, DMSO và ethylen glycon khử nước tự do trong nội bào và tế bào giúp bảo vệ cytoplasm đi vào trong.
Ở người chất bảo quản phôi thường được sử dụng là 1,2- propannediol
(PROH) và dimethyl sufoxide DMSO.
Khả năng sống sót của phôi liên quan đến nồng độ các chất bảo quản đông lạnh được thêm vào, phương pháp thêm chúng, nhiệt độ mà tại đó được thêm vào và cuối cùng là thời gian cân bằng.
Dụng cụ chứa phôi trong đông lạnh: có thể là các ống nhựa nhỏ, ống thuốc tiêm hay các cọng rạ dùng cho đông lạnh tinh trùng.
Thiết bị làm lạnh và đông: trong phương pháp làm lạnh và đông có thể sử dụng ancohol đặt vào vật chứa như là môi trường làm sạch, sau đó đưa vào đá khô hay nito lỏng. Trong các thiết bị chuyên dùng làm lạnh là nito lỏng nhưng nguồn điện cũng được sử dụng để hạ nhiệt. Một số thiết bị hiện đại có thể được chương trình hóa tốc độ giảm nhiệt, nên việc đông lạnh trở nên dể dàng và hiệu quả cao.
Tốc độ làm lạnh: <= 1oC/1 phút
7.1.2. Đông lạnh tinh trùng a.Chất bảo quản lạnh (Ởngười): a.Chất bảo quản lạnh (Ởngười):
Thành phần dung dịch đệm cơ bản bao gồm 3 thể tích 0,1M sodium citrate, 1 thể tích 0,33M fructose và 1 thể tích 0,33M glucose.
Môi trường đông lạnh: 4ml lòng đỏ trứng thêm vào 3ml glycerol và 13ml dung
đệm cơ bản, bất hoạt ở 56oC trong 30 phút và để lạnh. Cuối cùng 200mg glyceril
được thêm vào và chỉnh pH về 7,2 – 7,3.
51
Đông lạnh nhanh: đặt cọng rạ chứa dung dịch vào hơi (khí) nito lỏng trong 8- 30
phút, sau đó đặt thẳng cọng rạ vào nito lỏng.
Đông lạnh chậm: giảm nhiệt từ -5oC đến -9oC, -40oC đến -80oC, đặt cọng rạ vào
nito lỏng.
7.1.3. Đông lạnh trứng
a.Đông lạnh trứng:
Trứng rửa với dung dịch ấm PBS +30%HSA, chuyển sang 1,5M propannediol + 0,2M sucrose và cân bằng 15 phút trước khi nạp vào cọng rạ.
b.Giải đông trứng:
Các cọng rạ giải đông nhanh ở 30oC trong bể ổn nhiệt với 40 giây, chất bảo quản lạnh tách tách bỏ theo từng bước pha loãng ở nhiệt độ phòng.
0,1M propannediol + 0,2M sucrose, 5 phút
1,5M propannediol + 0,2M sucrose, 5 phút
0,2M sucrose, 10 phút
Dung dịch PBS :10 phút tại nhiệt độ phòng.
Chuyển vào môi trường nuôi ở 36oC
7.1.4. Xác định giới tính phôi
7.1.4.1.Xác định giới tính của phôi bằng phương pháp di truyền tế bào a. Barr body
Gardner và Edwards (1968) đã báo cáo rằng có thể xác định giới tính bằng sử dụng Barr body của phôi nang (6-8 ngày tuổi) ở thỏ nuôi. Tuy nhiên, nhìn chung, rất khó quan sát Barr body của tế bào phôi vật nuôi bởi vì sự có mặt của những hạt nhỏ (granule) trong nguyên sinh chất (cytoplasm). Trong một số trường hợp, phôi cái có thể bị nhầm thành phôi đực. Vì thể, phương pháp này không thể áp dụng trong sản xuất.