Tính chất vật lýTính chất vật lý Giá trị Giá trị- 123docz.net

I. TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]: TỔNG QUAN VỀ ENZYM PAPAIN [2]:

Tính chất vật lýTính chất vật lý Giá trị Giá trị

Tính chất vật lý Giá trịGiá trị Điểm đẳng điện Điểm đẳng điện pI = 8,75pI = 8,75 Hằng số lắng S Hằng số lắng S2020 2,42 ± 0,042,42 ± 0,04 Hằng số phân tán D

Hằng số phân tán D2020 (10 (10-7-7giây.cmgiây.cm22)) 10,27 ± 0,1310,27 ± 0,13 Phân tử lượng Phân tử lượng 2070020700 Độ triền quang [ Độ triền quang [αα]D]D -66,7-66,7oo Độ xoắn Độ xoắn 17%17% Vịng hiệu ứng coton Vịng hiệu ứng coton 290nm290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) Thể tích riêng phần V(mL/g) 0,7240,724 Trị số ma sát f/f Trị số ma sát f/foo 1,161,16

Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, khơng tan trong hầu hết các chất hữu Bột màu vàng hay nâu nhạt tùy thuộc phương pháp sấy, khơng tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine.

cơ nhưng tan một phần trong nước hay glycerine. Bền nhiệt. Bền nhiệt. javascript:dtPopImg('dbi_860353_img1') javascript:dtPopImg('dbi_860353_img1') 2. 2. Tính chất hĩa họcTính chất hĩa học:: 

 Cấu tạo hĩa học Cấu tạo hĩa học :: -

- Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S.Papain là một endoprotease chứa 16,1% N và 1,2% S. -

- Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212Theo kết quả phân tích bằng tia X, papain là một chuỗi polypeptide gồm 212 amino acid khơng chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, amino acid khơng chứa methionine, đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, cĩ 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 cĩ 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200

khơng cĩ chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và khơng cĩ chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc và một nhĩm –SH tự do ở vị trí cysteine 25.

một nhĩm –SH tự do ở vị trí cysteine 25. -

- Papain chưa hoạt hĩa là hỗn hợp protein disulfurcysteine.Papain chưa hoạt hĩa là hỗn hợp protein disulfurcysteine.



 Cấu trúc khơng gian:Cấu trúc khơng gian:

Phân tử papain cĩ dạng cầu, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Phân tử papain cĩ dạng cầu, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhĩm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt khe này, nhĩm –SH của cysteine 25 ở bên trái khe và nhĩm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn

nhĩm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn αα chiếm 20% tồn bộ các amino acid cĩ chiếm 20% tồn bộ các amino acid cĩ trong phân tử.

trong phân tử.

Phân tử papain cĩ hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai Phân tử papain cĩ hai nhân kỵ nước, mỗi nhân nằm ở một phần của papain và cả hai nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn

nhân đều bắt đầu với một chuỗi xoắn αα. Ngồi ra trong phân tử cịn chứa một số cầu nối nội. Ngồi ra trong phân tử cịn chứa một số cầu nối nội phân tử.

phân tử.



 Cấu trúc tâm hoạt động của papain:Cấu trúc tâm hoạt động của papain:

Tâm hoạt động của papain gồm nhĩm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của Tâm hoạt động của papain gồm nhĩm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đĩ nhĩm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên histidine 159. Bên cạnh đĩ nhĩm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen.

kết hydrogen.

Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là: Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys.

Lys – Asp – Glu – Gly – Ser – Cys – Gly – Ser – Cys.

Hình I.2.1: Tâm hoạt động của papain



 Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đĩng vai trị vừa Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid, đĩng vai trị vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.

như endopeptidase vừa như exopeptidase.

Các endopeptidase thuỷ phân protein chủ yếu thành peptid:

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)

(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)nn + HOH (-NH-CH(R)-COOH) + HOH (-NH-CH(R)-COOH)i i + (H + (H22N-CH(R)-CO-)N-CH(R)-CO-)kk

Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành các amino acid

So với các protease cĩ nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain cĩ khả năng So với các protease cĩ nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain cĩ khả năng thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nĩ cĩ khả năng phân hủy hầu thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nĩ cĩ khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid cĩ nhĩm carboxyl tự hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid cĩ nhĩm carboxyl tự do. Papain cĩ thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ do. Papain cĩ thể nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi cĩ phenylalanine như sau: nếu peptide cĩ dạng X- ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi cĩ phenylalanine như sau: nếu peptide cĩ dạng X- Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữaY và Z, nhưng nếu Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trí giữaY và Z, nhưng nếu peptide cĩ dạng X-Phe-Y (cĩ Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì khơng được peptide cĩ dạng X-Phe-Y (cĩ Phe nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng) thì khơng được thủy phân bởi papain.

thủy phân bởi papain.

Ngồi ra papain cịn cĩ hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase. Ngồi ra papain cịn cĩ hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase.



 Hoạt hố papain:Hoạt hố papain:

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhĩm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhĩm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hĩa để đưa papain từ trạng thái khơng hoạt động sang trạng thái hoạt phải sử dụng chất hoạt hĩa để đưa papain từ trạng thái khơng hoạt động sang trạng thái hoạt động. Do trung tâm hoạt động của papain cĩ tính khử nên các chất hoạt hĩa là các chất cĩ tính động. Do trung tâm hoạt động của papain cĩ tính khử nên các chất hoạt hĩa là các chất cĩ tính khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic… Trong đĩ cysteine là chất hay dùng nhất. Khi khử như cysteine, glutation acid, hydrocyanic… Trong đĩ cysteine là chất hay dùng nhất. Khi cĩ mặt các chất này thì nhĩm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để cĩ mặt các chất này thì nhĩm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain. Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đĩ thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đĩ cysteine đĩng vai trị là chất hoạt hĩa papain, cịn EDTA đĩng vai trị chất liên kết tạo phức cysteine đĩng vai trị là chất hoạt hĩa papain, cịn EDTA đĩng vai trị chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng cĩ trong nhựa đu đủ.

với ion kim loại nặng cĩ trong nhựa đu đủ.



 Bất hoạt:Bất hoạt:

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hố như: O

Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hố như: O22, O, O33, H, H22OO22,, iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhĩm –SH ở iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác. Các chất này phản ứng với nhĩm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nĩ.

trung tâm hoạt động của papain và làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nĩ.

Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi khơng khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi khơng khí, cysteine ở nồng độ thấp. Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hồn tồn hoạt tính. Tuy nhiên papain dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hồn tồn hoạt tính. Tuy nhiên papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung mơi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung mơi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như khơng biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M).

khơng biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6 - 8 M).



 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:

•

• Nhiệt độ:Nhiệt độ:

Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khơ papain khơng bị Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khơ papain khơng bị biến tính trong 3 giờ ở 100

biến tính trong 3 giờ ở 100ooC. Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5C. Ở dạng dung dịch, papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5ooCC và nếu tăng nhiệt độ trên 100

và nếu tăng nhiệt độ trên 100ooC thì sẽ mất hồn tồn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chấtC thì sẽ mất hồn tồn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hĩa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hồn tồn.

hoạt hĩa vào dung dịch vì cấu trúc tâm hoạt động của enzym đã bị phá hủy hồn tồn.

Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể cĩ độ bền nhiệt thấp hơn papain ở Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể cĩ độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa cịn chứa các protein khác cĩ tác dụng bảo vệ nĩ. Papain trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa cịn chứa các protein khác cĩ tác dụng bảo vệ nĩ. Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4

trong dung dịch NaCl giữ ở 4ooC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân,C bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng khơng mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày papain cũng khơng mất hoạt tính trong nhiều tháng, trong khi enzym mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hố. Papain dạng ổn định (cĩ cấu trúc khơng gian ổn định) ở 1-2% do sự tự phân hoặc oxi hố. Papain dạng ổn định (cĩ cấu trúc khơng gian ổn định) ở (H

(H22N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)N-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)nn + HOH (H + HOH (H22N-CH(R)-COOH)N-CH(R)-COOH)n’ n’ + (H + (H22N-CH(R)-CO-)N-CH(R)-CO-)k’k’

trạng thái khơ cĩ thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115

trạng thái khơ cĩ thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115ooC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì đượcC trong 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%.

90%.

•

• pH:pH:

Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong mơi trường acid cĩ pH < 4,5 hoặc trong mơi trường kiềm mạnh cĩ pH > 12. Tuỳ thuộc trong mơi trường acid cĩ pH < 4,5 hoặc trong mơi trường kiềm mạnh cĩ pH > 12. Tuỳ thuộc bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn định cĩ thể chịu bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papain khác nhau. Papain dạng ổn định cĩ thể chịu được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút.

được pH = 1,5 và pH = 8,5 trong 90 phút.

•

• Dung mơi:Dung mơi:

Papain khơng thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, khơng bị giảm hoạt tính Papain khơng thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, khơng bị giảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung mơi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dịch TCA trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung mơi hữu cơ và urea 8M, nhưng trong dung dịch TCA 10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch.

10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch.

II.

II. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]:PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PAPAIN [2], [4], [7]:Quy trình cơng nghệ: Quy trình cơng nghệ: Quy trình cơng nghệ: Nguyên liệu Nghiền Trích ly bã cát sạch celite

Lọc Chỉnh pH Lọc Kết tủa bã tủa xám NaOH (NH4)2SO4 phân đoạn 1 Ly tâm 1 Ly tâm 2 Kết tinh dịch lỏng dịch lỏng

NaCL rắn phân đoạn 2Kết tủa

Papain Tái kết tinh

Sấy chân không dd NaCl

bão hòa