vơ trùng…
Trong bài này, phenol và guanidinium thiocyanate cĩ trong thành phần d Trizol là những chất biến tính protein mạnh. khi xử lý với hai hố chất này, tế bào vi khuẩn sẽ phá vỡ và giải phĩng các thành phần nội bào : DNA, RNA, protein…Sau khi li tâm , dung dịch vi khuẩn xử lý với Trizol sẽ phân tách thành hai lớp : lớp dưới là phenol chứa DNA, lớp trên là nứơc chứa RNA. Phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ cùng với DNA trong pha phenol. Ngồi tác dụng biến tính protein, phenol ở pH4 cịn cĩ tác dụng hấp thụ DNA vào pha phenol. Vì vậy phần dịch nổi ở trên chỉ cịn chứa RNA. RNA sẽ thu nhận bằng cách tủa với isopropanol lạnh. Phương pháp tách chiết RNA này cho phép thu nhận RNA tồn phần cĩ chất lượng đủ đảm bảo cho các thao tác sinh học phân tử tiếp theo.
II- DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT1 – Hố chất 1 – Hố chất
• Dung dịch phenol 4 pH
• Ethanol 70% bảo quản lạnh
• Potasium acétat 5%
2 – Vật liệu và dụng cụ
• Vi khuẩn E.Coli hoặc nấm men
• Eppendorf 1,5ml
• Eppendorf 2ml
• Pipetman các loại 20µl – 100µl, 200µl - 1000µl đầu típ tương ứng
• Pipette pasteur
• Ống nghiệm thuỷ tinh
• Cốc đựng típ và chất thải
• Vải lược, dao cắt
• Máy nghiền
• Máy li tâm
Mỗi nhĩm chuẩn bị 2 Eppendorf 1.5ml chứa: - Dung dịch phenol 600µl
III – PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
Tiến hành theo các bước sau
Bước 1
Nhĩm trực cân 30g mẫu men , bổ sung 70ml nước cất, nghiền nhỏ. Dùng vải lọc để lọc phần nghiền để thu dịch đồng nhất.
Bước 2
Mỗi nhĩm bổ sung vào eppendorf 1.5 thêm 100µl dịch đồng nhất , tiến hành vortex trong 10 phút sau đĩ ly tâm 5.000vịng/phút trong 10phút
Bước 3
Hút phần dịch nổi khoảng 500µl. Đem ly tâm 7.000vịng/phút trong 10 phút.
Bước 4
Thu 400µl dịch nổi vào Eppendorf khác, bổ sung 100µl potassium acétat 5% và 500µl ethanol lạnh.Vortex 10 phút (ủ lạnh và vortex gián đoạn) .Ly tâm 7000vịng/phút trong 15 phút
Bước 5
Hút bỏ dịch nổi, bảo quản lạnh âm .
IV – YÊU CẦU
Mỗi nhĩm thu nhận RNA vào một eppendorf sạch cĩ ghi tên nhĩm, lưu trữ để làm nguyên liệu cho bài sau.
BÀI 10:
ĐỊNH LƯỢNG ACID NUCLEIC BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG MẬT ĐỘ QUANG
I - NGUYÊN TẮC
Ánh sáng khi đi qua mơi trường lỏng sẽ bị các phần tử vật chất trong mơi trường đĩ hấp thu một phần. sự hấp thu ánh sáng gia tăng khi nồng độ các phần tử vật chất trong mơi trường đĩ gia tăng. Dựa vào nguyên lý trên người ta cĩ thể đo nồng độ các phần tử vật chất trong mơi trường lỏng thơng qua mối quan hệ giữa cường độ ánh sáng trước và sau khi đi qua mơi trường.
Mỗi loại phân tử cĩ một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sĩng nhất định tuỳ thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ : đỉnh hấp thụ các nucleic acid là ở 260nm trong vùng tử ngoại. sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vịng purine và pyrimidine.
Sự hấp thụ ở dây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Một đơn vị đơn vị hệ số chuyển đổi OD tương ứng với :