1 – Máy lắc ổn nhiệt: được sử dụng cho các phản ứng cần nhiện độ ổn định (phản ứng enzyme, lai…). Máy bao gồm một bể nước cĩ nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc enzyme, lai…). Máy bao gồm một bể nước cĩ nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc
2 – Tủ cấy vơ trùng: được sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vơ trùng. Tủ phải luơn được giữ sạch, bề mặt thí nghiệm được khử trùng bằng cồn. Trước và sau khi sử dụng, phải thanh được giữ sạch, bề mặt thí nghiệm được khử trùng bằng cồn. Trước và sau khi sử dụng, phải thanh trùng bên trong tủ bằng cách bật đèn tử ngoại trong ít nhất 15 phút.
3- Máy li tâm: dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong một dung dịch Nguyên tắc: Sự phân tách các phần tử khác nhau trong một dung dịch được thực hiện dựa Nguyên tắc: Sự phân tách các phần tử khác nhau trong một dung dịch được thực hiện dựa trên vận tốc lắng khác nhau của chúng dưới tác động của một lực li tâm. Tuỳ thuộc vào đặc điểm dùng để Phân tách (khối lượng hay tỉ trọng của các phần tử vật chất) mà người ta chia làm hai loại: Li tâm phân đoạn vàli tâm đẳng tỉ trọng.
Li tâm phân đoạn (li tâm vùng)
Phương pháp này cho phép phân tách các phần tử vật chất dựa vàokhối lượng của chúng. Các phần tử vật chất sẽ di chuyển về phía đáy ống li tâm với vận tốc tuỳ thuộc lực li tâm và sự ma sát giữa chúng với dung dịch li tâm tức tuỳ thuộc vào hình dạng các phần tử). Như vậy trong li tâm vùng, để thu nhận một loại phần tử vật chất nhất định cần sử dụng một lực li tâm và thời gian li tâm nhất định phù hợp
Li tâm đẳng tỉ trọng
Đây là phương pháp phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỉ trọng giữa chúng. Phương pháp này cho hiệu quả phân tách ất cao, các phân đoạn được phân tách rất thuần khiết. Ống li tâm chứa một dung dịch cĩtỉtrọng tăng dần từ miệng đến ống tạo nên một gradient tỉ trọng. Tỉ trọng của các phần tử cần phân tách phải nằm trong vùng gradient tỉ trọng này. Trong quá trình li tâm, các phần tử vật chất sẽ lắng xuống đáy ống, khi đến vùng dung dịch cĩ tỉ trọng tương đương, phân tử sẽ dừng lại do đã đạt trạng thái cân bằng. Trạng thái này khơng thay đổi dù tăng thời gian hay lực li tâm. Các loại phân tử thường được dùng để thiết lập gradient tỉ trọng là saccharose hay glycerol khi cần phân đoạn các bào qua, cesium chloride (CsCl) khi cần phân tách protein và nucleic acide.
IV- THỰC HÀNH
Sinh viên quan sát các thiết bị, tập cách sử dụng micropipette
V – YÊU CẦU
Sử dụng đúng cách và đúng mục đích các loại hố chất, dụng cụ, thiết bị trong quá trình thực hành sau này.
TÁCH CHIẾT ADN THEO PHƯƠNG PHÁP BOOM
I –NGUYÊN TẮC:
Việc thu nhận DNA từ mơ gan được tiến hành thơng qua nhiều bước.
Phân đoạn nhân được cơ lập trong bước thứ nhất và DNA được tách chiếttrong bước thứ hai chủ yếu dựa trên kỹ thuật li tâm vùng.
Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân
(2) Loại protein (3) Tủa DNA
Phá màng tế bào và màng nhân
Mơ gan thường được sử dụng làm vật liệu để cơ lập nhân và tách chiết DNA vì tế bào gan tương đối đồng nhất về kích thước, thích hợp cho việc phân đoạn kỹ thuật li tâm. Người tacĩ thể phá màng tế bào bằng phương pháp hố học, cơ học hay siêu âm. Để đảm bảo sự tồn vẹn cấu trúc của các bào quan, tế bào được phá vỡ trong những điều kiện gần với điều kiện sinh lý bình thường (dung dịch đẳng trưởng, pH sinh lý, sự hiện diện của một số Ion…). Huyền phù tế bào trong mơi trường vừa kể cĩ tên là dịch đồng nhất (homogenate). Dịch đồng nhất được phân đoạn qua li tâm, các bào qua sẽ được phân tách dựa vào khối lượng của chúng.
Loại protein
Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần nhiễm, mà quan trọngnhất là Protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hồ tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acide / protein) trong hai pha khơng hồ tan Phenol, chloroform). Một số tác nhân tách chiết thơng dụng là:
(1) Phenol: một chất biến tính protein mạnh, khơng hồ tan nucleic acid
(2) Chloroform: thường đi kèm với phenol, cĩ tác dụng bổ sung và loại bỏ hồn tồn dấu vết phenol, chloroform cũng làm tan biến tính protein nhưng yếu hơnphennol; isoamylaclohol làm giảm bọt , ổn định hai pha nước và chloroform sau li tâm
(3) Isobutanol: cĩ hai cơng dụng là tách các phân tử hữu cơ như ethidium bromide và làm đậm dung dịch nucleic acid
(4) Cũng cĩ thể tĩm bắt acid Nucleic bằng các hạt celite mà khơng cần bắt các protein biến tính
Tủa DNA
Sau cơng đoạn tách chiết, nucleic acid được tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với li tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần cĩ thể hồ lại trong nước tho nồgn độ mong muốn. Cĩ các kiểu chính: