3. Đối tợng nghiên cứu
1.2.3.2. Vai trò của flavonoit trong cây
1.2.3.2.1. Các phản ứng sinh hóa
Các nhóm phenol của flavonoit có vai trò trong sự hoà tan các chất và di chuyển dễ dàng qua màng sinh lý.
Một số flavonoit có tác dụng nh một chất chống ôxy hoá, bảo vệ axit ascocbic, một thành phần quan trọng trong tế bào thực vật. Một số có tác dụng ức chế các enzim và chất độc của cây.
1.2.3.2.2. Vai trò ức chế và kích thích sinh tr-ởng ởng
Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng ức chế và kích thích sinh tr- ởng cây của flavonoit. Nhóm chức hydroxyl có vai trò quyết định về tác dụng này. Ví dụ: Trong cây ổi, các flavonoit có nhóm OH ở vị trí 4’ làm tăng cờng hoạt tính của enzim trong khi các flavonoit có OH ở 3’ và 4’ lại có tính ức chế. Flavonoit còn tham gia vào sự hô hấp quang hợp.
1.2.3.2.3. Vai trò tạo màu sắc
Flavonoit đóng vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa quả.
Sâu bọ, nhờ hệ thống thị giác đặc biệt, chúng rất nhạy cảm đối với màu sắc của cây cỏ. Thực nghiệm cho thấy các loài ong thích màu xanh và màu vàng, các loài bớm thích màu hồng và màu trắng, các loài ruồi thích màu trắng, còn các loài chim sâu thích màu đỏ (Harbone, 1975).
1.2.3.2.4. Vai trò một chất bảo vệ cây
Một số flavonoit không màu có trong lá đóng vai trò 1 chất bảo vệ cây, ngăn trở đối với các động vật ăn cỏ. Vị đắng và khó chịu của flavonoit làm cho động vật khi ăn phải mất cảm giác ngon và không thích ăn các loại cây cỏ này.
Querxetin với nồng độ rất thấp đã có cảm giác mất ngon, nhng liều 0,2% sẽ gây ức chế sự bài tiết nớc ngọt.
1.2.3.3. Vai trò của flavonoit trong y học
Powers (1964) đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của 24 loại flavonoit trên 10 chủng vi khuẩn. Hầu hết flavonoit đều ức chế hô hấp và sự
tái sinh sản ở nồng độ 1-2à mol trong môi trờng có glucoza. Với 24 chất thử không có chất nào không có tác dụng dới 9 trong số 10 vi khuẩn thử.
Trong chơng trình sàng lọc chất tác dụng với khối u đã phát hiện 1 số flavonoit có tác dụng đối với một số dạng ung th. Eupatin, eupatoretin (Kupchan, 1969), centauridin (Kupchan và Banerachmidt, 1971) đều có tác dụng vừa đối với carcinoma của ung th vòm họng.
Một tác dụng quan trọng của flavonoit là nâng cao tính bền của thành mạch máu.
Năm 1963 Ruszuyak và Szent-Gyorgyi cấp mẫu thuốc vitamin C chiết từ quả chanh cho thầy thuốc để dùng cho một bệnh nhân bị chảy máu thành mạch. Bệnh nhân khỏi bệnh. Về sau lại cấp 1 mẫu khác tinh khiết hơn cho một bệnh nhân khác, nhng bệnh nhân này không khỏi bệnh. Xem lại mẫu thuốc trớc thì thấy còn chứa nhiều tạp chất flavon của quả chanh.
Tác dụng này có liên quan đến cấu trúc của flavonoit. Thực nghiệm cho thấy các flavonoit có nhóm OH tự do ở vị trí 3’,4’ có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này.
Tác dụng estrogen: Hiện tợng sẩy thai của Cừu ở úc là một vấn đề lớn đã đợc nghiên cứu ở nớc này. Nguyên nhân chủ yếu gây ra hiện tợng này là do Cừu ăn một loại cây Trifolium subterraneum có một chất isoflavon là genistein với hàm lợng 0,7% trong lá. Trên thực nghiệm chất này có tác dụng estrogen trên chuột nhắt.
Bickoff và cộng sự (1957) cũng lấy từ Trifolium repens một chất có tác dụng estrogen mạnh gấp từ 90 - 100 lần so với isoflavon của Trifolium subterraneum. Tác dụng estrogen của những chất trên có thể hiểu đợc do có sự giống nhau về cấu trúc hoá học giữa chúng với chất estrogen tổng hợp dietylstiboestrol.
O OH O OH O H genistein O H OH dietylstiboestrol
Pretorius (1958) đã nghiên cứu tác dụng estrogen của một số nhóm hợp chất flavonoit, cho thấy các glucozit quecxetin và kaempfrol 3 - ramno galacto - 7 ramnozit đều có tác dụng estrogen. Tác dụng 50 mg các chất này tơng đơng với tác dụng của 0,034 g dietylstilboestrol.
Ngoài các tác dụng trên, flavonoit còn có những tác dụng khác nh: Chống dị ứng, chống co dật, giảm đau, giãn mạch, giãn phế quản, lợi mật, và tác dụng diệt nấm.
1.2.4. Công dụng [1, 18]
Huyết đằng (Sargentodoxa cuneata) có tác dụng chữa kinh bế, đau bụng, phong thấp, giun kim, giun đũa, chữa viêm ruột thừa giai đoạn đầu, chữa mng mủ. Trong y học Trung Quốc, phần thân cây huyết đằng đợc dùng đễ chữa trị viêm khớp dạng thấp, đau bụng, viêm ruột thừa cấp tính, chứng thống kinh, chứng vô kinh, chấn thơng và đau khi hành kinh.
Chơng II: Phơng pháp nghiên cứu
2.1. Phơng pháp lấy mẫu
Mẫu thực vật đợc thu hái vào tháng 9/2006. Mẫu tơi sau khi lấy về đợc rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đợc hỗn hợp chất dùng cho nghiên cứu đợc nêu ở phần thực nghiệm.
2.2. Phơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chất
Để phân tích và phân tách cũng nh phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phơng pháp sắc ký nh: - Sắc ký khí-khối phổ liên hợp (GC-MS) - Sắc ký lớp mỏng (TLC) - Sắc ký cột thờng (CC) - Sắc ký cột nhanh (FC) - Sắc ký lớp mỏng cao áp (HPLC) - Các phơng pháp kết tinh phân đoạn.
Các bớc của quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hoà tan nóng và lọc, để kết tinh ở lạnh, gạn tinh thể ra khỏi dung dịch mẹ và làm khô tinh thể. Trong các bớc trên thì việc chọn dung môi có tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh.
2.3. Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp các phơng pháp phổ: - Phổ khối lợng (EI - MS).
- Phổ cộng hởng từ hạt nhân 1H - NMR. - Phổ cộng hởng từ hạt nhân 13C - NMR. - Phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều DEPT.
Chơng III: Thực nghiệm
3.1. Thiết bị và phơng pháp
3.1.1. Hoá chất
Các dung môi để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết (PA).
3.1.2. Các phơng pháp sắc ký
Sắc ký cột
Sắc ký cột sử dụng silicagel 254 (Merck) Tinh chế các hợp chất
Các hợp chất đợc tinh chế bằng cách kết tinh phân đoạn.
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Máy quay cất chân không. Máy đo điểm chảy.
Máy đo phổ tử ngoại UV. Máy đo phổ hồng ngoại IR. Máy đo phổ khối lợng EI-MS. Máy đo phổ 1H-NMR.
Máy đo phổ 13C-NMR.
Máy đo phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều DEPT.
3.2. Nghiên cứu tách và xác định một số chất từ cây huyết đằng
3.2.1. Lấy mẫu
Mẫu thực vật đợc thu hái vào tháng 9/2006 ở Thạch Hà - Hà Tĩnh và đ- ợc xác định bởi PGS - TS Vũ Xuân Phơng Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
3.2.2. Xử lý mẫu
Mẫu thực vật đợc phơi khô và xay nhỏ vừa phải, ngâm với metanol (20 ngày). Dịch chiết đợc cất thu hồi dung môi thu đợc cao metanol, rồi sau đó chiết lần lợt với n-hexan, cloroform, butanol, cất thu hồi dung môi thu đợc các dịch chiết tơng ứng.
3.2.3 Xử lý cao
Cao butanol đợc trộn theo tỷ lệ thích hợp với silicagel (254-Merck) vừa đủ rồi cho vào cột sắc ký đã đợc nhồi bằng pha tĩnh silicagel. Tiến hành sắc ký với các hệ dung môi triển khai theo tỷ lệ thay đổi (bảng1), lấy lần lợt những thể tích xác định dung dịch chảy ra khỏi cột. Cất thu hồi dung môi, dùng axeton hoặc metanol để rửa chất thu đợc còn đọng lại trong bình cầu. Tiếp tục sắc ký với các hệ dung môi cũ hoặc mới tuỳ vào sự thay đổi màu sắc và chất cất đợc.
Bảng 1: Số liệu của quá trình chạy sắc ký cột cao butanol STT Hệ dung môi
CH3Cl/CH3OH/H2O Tỷ lệ Phân đoạn 1 CH3Cl/CH3OH/H2O 30 : 1 : 0,05 SCB1 2 CH3Cl/CH3OH/H2O 20 : 1 : 0,05 SCB2→SCB9 3 CH3Cl/CH3OH/H2O 10 : 1 : 0,05 SCB10→SCB28 4 CH3Cl/CH3OH/H2O 4 : 1 : 0,05 SCB29→SCB33 5 CH3Cl/CH3OH/H2O 2 : 1 : 0,05 SCB49→SCB82 6 CH3Cl/CH3OH/H2O 1 : 1 : 0,05 SCB83→SCB14
Khi chạy với hệ dung môi theo thứ tự thì thấy có sự thay đổi màu trên cột sắc ký: lớp trên cùng có màu vàng chanh, lớp thứ hai có màu vàng da cam, lớp thứ 3 có màu đỏ dâu, lớp thứ 4 có màu đỏ thẫm và lớp cuối cùng có màu đỏ thẫm nhạt dần.
Quá trình chạy cột cao butanol với các hệ dung môi rửa giải nh trên thu đợc 114 phân đoạn. Trong đó phân đoạn SCB3 thu đợc một chất (chất A), phân đoạn SCB11-SCB12 thu đợc một chất (chất B). Tiến hành làm sạch và kết tinh lại thu đợc các chất A và chất B tơng ứng.
Rễ khô
Cặn cao CH3OH
- Chiết hồi lưu với CH3OH (4 lần) - Cất loại CH3OH
- Chiết lần lượt với n-hexan, cloroform, butanol.
- Cất thu hồi dung môi.
dịch chiết
n-hexan dịch chiếtcloroform dịch chiết butanol dịch nước còn lại
cao butanol
Phân đoạn SCB 3
Chất A
Sắc ký cột hệ dung môi CH3Cl:CH3OH: HOH cao n-hexan cao cloroform
Phân đoạn SCB11-SCB12
Chất B Sơ đồ 2: Phân lập một số hợp chất trong rễ cây huyết đằng
Các chất A và B đợc đo điểm chảy, chụp phổ để xác định cấu trúc tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chơng IV: kết quả và thảo luận
4.1. Nguyên liệu thực vật
Mẫu rễ của cây huyết đằng Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. Et Wils đợc lấy vào tháng 9/2006 tại Thạch Hà, Hà Tĩnh.
4.2. Chiết xuất và phân lập
Rễ cây huyết đằng (Sargentodoxa cuneata) đợc rửa sạch, phơi khô, xay nhỏ vừa phải, ngâm chiết trong metanol. Dịch chiết đợc cất thu hồi dung môi, rồi sau đó chiết lần lợt với n-hexan, cloroform, n-butanol thu đợc dịch chiết tơng ứng.
Cao butanol đợc phân tách bằng sắc ký cột, rửa giải bằng hệ dung môi CH3Cl/CH3OH/H2O thu đợc chất A và chất B.
4.3. Xác định cấu trúc phân tử của các chất A và B
4.3.1. Xác định cấu trúc phân tử của chất A
Cấu trúc của chất A đợc xác định dựa vào phơng pháp đo các loại phổ: Phổ khối lợng EI-MS, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều DEPT, phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều HMBC, HSQC, COSY.
Hình 8: Phổ DEPT của hợp chất A
Trên phổ khối lợng EI-MS của chất A (hình2) có pic ion phân tử m/z = 268, tơng ứng với công thức phân tử C16H12O4 và một số pic khác có cờng
độ lớn [M+- ] m/z = 253 [ ]CH3 C CH
OMe + C( 9H8O+) hình thành do
sự phân cắt Retro - Diels - Alder (m/z = 132).
Trên phổ 1H-NMR của chất A (hình3), ta thấy có tín hiệu cộng hởng của nhóm -OCH3 có độ chuyển dịch hóa học δ = 3,791ppm. Tín hiệu cộng h- ởng của (H-3) δ = 6,95ppm. Tín hiệu cộng hởng của các proton nhân thơm: (H-5) δ = 8,32ppm; (H-7) δ = 7,98ppm; (H-8) δ = 6,87ppm; (H-2’/H-6’) δ = 7,52ppm; (H-3’/H-5’) δ = 7,14ppm; (OH) δ = 10,78.
Trên phổ 13C-NMR của chất A (hình4), ta thấy có tín hiệu: δ = 157,409ppm (C-2); δ = 102,086ppm (C-3); δ = 174,570ppm (C-4); δ = 113,554ppm (C-4a); δ = 123,134ppm (C-5); δ = 162,53ppm (C-6); δ = 116,590ppm (C-7); δ = 115,114ppm (C-8); δ = 127,244ppm (C-9); δ = 124,219ppm (C-1’); δ = 116,599ppm (C-2’, 6’); δ = 130,048ppm (C-3’, C- 5’); δ = 158,294ppm (C-4’). Số liệu đợc trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất A Vị trí
Cacbon Độ dịch chuyển hóa học (ppm)
C-2 157,409 C-3 102,086 C-4 174,570 C-4a 113,554 C-5 123,134 C-6 162,53 C-7 116,590 C-8 115,114 C-9 127,244 C-1’ 124,219 C-2’; C-6’ 116,599
C-4’ 158,924
Các số liệu từ các phổ thực nghiệm thu đợc so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định cấu trúc của hợp chất A là 6 - hydroxy - 4’ - metoxy flavon.
O OMe O O H 1 2 3 4 5 6 7 9 8 4a 1' 2' 3' 4' 5' 6'
Hợp chất A: 6 - hydroxy - 4' - metoxy flavon
4.3.2. Xác định cấu trúc phân tử của chất B
Cấu trúc của chất B đợc xác định dựa vào phơng pháp đo các loại phổ: Phổ khối lợng EI-MS, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR, phổ cộng hởng từ hạt nhân một chiều DEPT.
Hình 11: Phổ DEPT của hợp chất B Phổ 1H - NMR (hình 9) của chất B có:
- Tín hiệu cộng hởng singlet của 6 nhóm CH3 từ 0,7 - 0,95ppm.
- Tín hiệu cộng hởng từ vùng 0,95 - 1,95ppm là vùng xen phủ dày đặc của các nhóm CH và CH2 trong vùng. Phổ 13C - NMR của chất B (hình10) có: δ(ppm) 36,8 (C-1); 31,4 (C-2); 70,1 (C-3); 40,1 (C-4); 140,4 (C-5); 121,1 (C-6); 38,2 (C-7); 31,3 (C-8); 99,6 (C-9); 36,8 (C-10); 20,6 (C-11); 39,8 (C-12); 41,8 (C-13); 56,2 (C-14); 23,8 (C-15); 28,7 (C-16); 11,7 (C-18); 19,7 (C-19); 36,2 (C-20); 18,9 (C-21); 33,4 (C- 22); 25,5 (C-23); 45,2 (C-24); 29,2 (C-25); 19,1 (C-26); 20,6 (C-27); 18,6 (C-29). Bảng 3: Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất B
Cacbon Độ dịch chuyển hóa học (ppm)
C-1 36,8 C-2 31,4 C-3 70,1 C-4 40,1 C-5 140,4 C-6 121,1 C-7 38,2 C-8 31,3 C-9 49,6 C-10 36,8 C-11 20,6 C-12 39,8 C-13 41,8 C-14 56,2 C-15 23,8 C-16 28,7 C-17 55,4 C-18 11,7 C-19 19,7 C-20 36,2 C-21 18,9 C-22 33,4 C-23 25,5 C-24 45,2
C-26 19,1
C-27 20,6
C-28 22,6
C-29 18,6
Các số liệu từ các phổ thực nghiệm thu đợc so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định cấu trúc của hợp chất B là: GluO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 `17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Hợp chất B: β -sitosterol glucozit
Kết luận Chung
Tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của rễ cây huyết đằng
Sargentodoxa cuneata (Oliv.) Rehd. Et Wils ở Thạch Hà, Hà Tĩnh. Chúng tôi đã thu đợc một số kết quả nh sau:
1. Bằng phơng pháp ngâm chiết với các dung môi chọn lọc rồi cất phân đoạn đã thu đợc các cao đặc trng tơng ứng là cao n-hexan, cloroform và butanol. Từ đó đã phân lập đợc các hợp chất A và B.
2. Đã xác định cấu trúc các chất A và B bằng một số phơng pháp vật lý hiện đại nh: Phổ EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, DEPT, HSQC, HMBC và phơng pháp so sánh với phổ chất chuẩn trong từ điển cấu trúc các hợp chất thiên nhiên. Kết quả phân tích cho thấy hợp chất A là: 6-hydroxy-4’-metoxy flavon, hợp chất B là: β - sitosterol glucozit.
Tài liệu tham khảo
Tiếng Việt
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chơng, Nguyễn Thợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển và những ngời khác (2004). 1000 cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập I. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
2. Võ Văn Chi (1997). 200 cây thuốc thông dụng. Nhà xuất bản tổng hợp Đồng Tháp.
3. Võ Văn Chi (1999). Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 4. Vũ Văn Chuyên (1976). Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc. Nhà xuất bản Y học.
5. Vũ Văn Chuyên, Lê Trần Chấn, Trần Hợp (1987). Địa lý các họ cây Việt Nam.
6. Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến (1999). Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc. Nhà xuất bản Y học.
7. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985). Các phơng pháp nghiên cứu cây thuốc. Nhà xuất bản Y học.
8. Trần Đình Đại (1998), Khái quát về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt -Đức về Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội 16-18/4/1998.
9. Nguyễn Hữu Đỉnh, Trần Thị Đà (1999). ứng dụng một số phơng pháp