Nghiên cứu côn trùng ký sinh Sâu khoang
a) Xác đi ̣nh diễn biến số lượng Sâu khoang và côn trùng ký sinh trên sinh quần ruô ̣ng la ̣c Tiến hành điều tra đi ̣nh kỳ 1 lần/tuần, trên 3 ruô ̣ng la ̣c cố đi ̣nh, mô ̣t ruô ̣ng la ̣c 300
- 500m2, cách nhau 100m. Điều tra theo nguyên tắc 5 điểm chéo góc/ruô ̣ng la ̣c, 1 điểm =
1m2 lac.
Thu bắt tất cả các giai đoa ̣n phát triển của Sâu khoang trên 5 điểm điều tra của mỗi ruô ̣ng đem về phòng thí nghiê ̣m nuôi theo dõi ký sinh.
Tiến hành điều tra tự do trên các ruô ̣ng la ̣c có nhiều Sâu khoang, 1 ruô ̣ng 300 -
500 m2. Nguyên tắc điều tra 5 điểm chéo góc/ ruô ̣ng la ̣c, 1 điểm = 1m2
Thu bắt tất cả các giai đoa ̣n phát triển của Sâu khoang trên 5 điểm điều tra của mỗi ruô ̣ng đem về phòng thí nghiê ̣m nuôi theo dõi ký sinh.
c) Phương pháp thu thâ ̣p mẫu côn trùng ký sinh Sâu khoang
Đối với Sâu khoang: Thu bắt tất cả các pha phát triển của Sâu khoang đem về nuôi trong phòng thí nghiệm để theo dõi, thu thập các loài côn trùng ký sinh. Nuôi ngài Sâu khoang đẻ trứng và nuôi ổ trứng để lấy sâu non Sâu khoang “sạch” được dùng trong các thí nghiệm về ong ký sinh.
Đối với ong ngoại ký sinh Euplectrus xanthocephalus Girault: thu bắt ký sinh trên
Sâu khoang ngoài đồng ruộng (ấu trùng, nhộng)
2.3.2 Nghiên cứu trong phòng thí nghiê ̣m2.3.2.1 Đi ̣nh loa ̣i côn trùng ký sinh sâu khoang 2.3.2.1 Đi ̣nh loa ̣i côn trùng ký sinh sâu khoang
a) Phương pháp xử lý, bảo quản mẫu vâ ̣t
Mẫu vật thu thập được bảo quản tại phòng thí nghiệm BVTV Khoa Nông Lâm Ngư bằng phương pháp bảo quản mẫu khô và bảo quản mẫu ướt.
Bảo quản ướt: Con trưởng thành của các loài côn trùng ký sinh thu được bảo quản
trong cồn 700C.
Bảo quản mẫu khô theo phương pháp làm mẫu khô của Khuất Đăng Long
Để định loại được ong ký sinh, mẫu tiêu bản ong ký sinh không những cần phải được giữ nguyên vẹn các phần của cơ thể mà chúng còn phải được giữ được màu sắc tự nhiên và hoa văn trên các phần cơ thể. Vì vậy, trước khi làm tiêu bản, những mẫu ong được bảo quản ướt trong cồn tuyệt đối cần phải được sấy khô. Mẫu ong ký sinh sau khi sấy khô phải đạt tiêu chuẩn cánh không bị quăn dính, bụng phải lộ rõ các tấm lưng và tấm bụng.
Có hai phương pháp sấy khô mẫu ong ký sinh, sử dụng CO2 lỏng và máy xấy tới hạn
CPD (Critical Point Dryer). Phương pháp này tương đối phức tạp nên không được trình bày ở đây.
Phương pháp sử dụng hóa chất để sấy mẫu ong ký sinh tương đối đơn giản hơn, đó là phương pháp AXA. Mẫu ong ký sinh sau khi sấy khô bằng phương pháp này cũng đạt tiêu chuẩn giống như xấy bằng CPD.
(1) Phương pháp làm khô mẫu ướt
Để có thể định loại được ong ký sinh, trước hết cần có mẫu tiêu bản khô. Tiêu bản ong ký sinh được cắm ghim trực tiếp lên cơ thể hoặc tiêu bản ong gắn ở đỉnh miếng giấy cứng hình tam giác (hình 2.2).
Mẫu ong ký sinh thu được bằng những phương pháp khác nhau (xem phần phương pháp thu mẫu). Riêng phương pháp thu mẫu bằng bẫy treo (Malaise trap) mẫu ong thu được thường là mẫu ướt giữ trong cồn 70%. Chính vì vậy, trước khi làm tiêu bản ong ký sinh, mẫu ong cần được sấy khô bằng phương pháp sử dụng một số hóa chất đặc biệt.
Mục đích của phương pháp này nhằm làm cho cơ thể ong được sạch và các phần của cơ thể không bị dính vào nhau. Sấy mẫu bằng phương pháp này đạt tiêu chuẩn gần với phương pháp sấy mẫu bằng máy sấy tới hạn (Critical Point Dryer-CPD).
Trước hết mẫu ong được vớt ra khỏi cồn 70% hoặc 96%, sau đó ngâm mẫu này trong dung dịch hỗn hợp gồm cồn tuyệt đối và xylen theo tỷ lệ 60/40, thời gian ngâm
trong hỗn hợp dung dịch này ít nhất 24 giờ. Sau thời gian này, vớt mẫu ra và ngâm trong dung dịch Amylacetate (trong trường hợp không có Amylacetate thì có thể thay thế bằng n-butylacetate). Thời gian ngâm mẫu trong dụng dịch này là 24 giờ hoặc lâu hơn. Sau đó, mẫu được vớt ra và đặt trên giấy thấm lọc trong đĩa Petri, dùng kim mổ côn trùng và panh mềm để chỉnh sửa cho ngay ngắn các phần cơ thể để sao cho khi soi trên kính được rõ ràng nhất. Đặc biệt là làm phẳng cánh và chân về hai phía. Sau khi chỉnh sửa các phần cơ thể của ong, mẫu được để khô tự nhiên trên mặt giấy trong đĩa Petri.
Thông thường với nhiệt độ trong phòng, mẫu ong ký sinh sẽ khô trong vòng 24 giờ. Sau khi mẫu đã khô, sử dụng panh mềm kẹp ong gắn vào đỉnh miếng giấy hình tam giác nhỏ (hình 2.2).
(2) Phương pháp làm mềm mẫu khô
Trong trường hợp thu ong ký sinh bằng vợt, sau đó mẫu ong ký sinh được giữ trong đệm bông, những mẫu này sẽ khô tự nhiên, chính vì vậy, để mẫu không bị dập gãy khi tách ra khỏi đệm bông, toàn bộ đệm bông được đặt ở trên một chiếc giá có lỗ nằm bên trong một bình hút ẩm có nắp đậy kín, dưới đáy bình có chứa nước+phenol hoặc thymol. Mẫu đệm bông được giữ qua đêm để cho mẫu ong khô hút ẩm trở lại và sẽ mềm ra (hình 2.1).
Sau 24 giờ, mẫu ong được tách khỏi đệm bông, sau đó dùng kim côn trùng và panh mềm để chỉnh sửa cho ngay ngắn các phần cơ thể của ong. Trước khi mẫu này được làm tiêu bản.
Hình 2.1 Sơ đồ làm mềm mẫu khô trước khi cắm ghim trực tiếp hoă ̣c gắn trên góc tam giác
(A): Bình hút ẩm, (B): Đĩa sứ thủng lỗ (3) Phương pháp làm tiêu bản mẫu ong ký sinh
Để có thể dễ dàng định loại ong ký sinh, hầu hết mẫu tiêu bản ong ký sinh thường được gắn vào đỉnh của miếng bìa cứng có hình tam giác nhỏ (pointed specimens). Đối với những mẫu ong ký sinh có kích thước cơ thể lớn, mẫu tiêu bản được cắm ghim (pinned specimens). Vị trí cắm ghim trực tiếp qua cơ thể ong được chỉ ra ở hình 2.2A. +) Phương pháp cắm ghim mẫu ong ký sinh
Việc cắm ghim tiêu bản thường được thực hiện với mẫu mới thu được hoặc mẫu ong có kích thước cơ thể khá lớn hoặc lớn, những mẫu này thường được cắm ghim ngay sau khi thu được bằng phương pháp nuôi sinh học, vợt (mẫu tươi) hoặc mẫu giữ trong đệm bông sau khi đã được làm mềm trở lại.
Phương pháp cắm ghim mẫu ong ký sinh được tiến hành như sau:
Đặt ong nằm úp mặt bụng ngay ngắn trên miếng xốp, dùng panh mềm ấn nhẹ và giữ chặt phần lưng đốt ngực, dùng ghim côn trùng cắm theo chiều thẳng đứng xuyên qua cơ thể ong và cố định mẫu ở khoảng cách về phía mũ ghim một đoạn bằng 1/3 chiều dài của ghim (hình 2.2A). Dùng ghim côn trùng để chỉnh các chân và ép phẳng cánh áp sát vào miếng xốp, giữ mẫu ở vị trí này tới khi mẫu tự khô hoặc để bên dưới cách bóng đèn dây tóc công xuất 40W ở khoảng cách 10 cm.
+) Phương pháp gắn mẫu ong ký sinh trên giấy
Phương pháp này được áp dụng cho hầu hết những mẫu ong có kích thước cơ thể nhỏ, và những mẫu ong ký sinh sau khi đã được sấy khô từ mẫu ướt.
Phương pháp gắn mẫu ong ký sinh được tiến hành như sau:
Trước hết chọn loại giấy dày (dày bằng 2 lớp loại giấy sử dụng cho giấy in), cắt giấy cứng thành hình những tam giác nhỏ có góc nhọn. Ghim côn trùng được cắm ở nửa đáy, cách đáy tam giác một đoạn bằng 1/3 chiều dài của tam giác nhỏ. Miếng giấy cứng hình tam giác nằm ở vị trí sao cho từ mũi nhọn của ghim đến miếng giấy cứng bằng 2/3 khoảng cách từ miếng giấy đến đầu mũ ghim (hình 2.2B).
Trước khi gắn mẫu tiêu bản, đỉnh miếng giấy hình tam giác được bẻ gập vuông góc xuống phía dưới, sau đó dùng lọai nhựa dán chuyên dùng hoặc balsam canada pha loãng với xylen chấm một lớp mỏng lên phần đỉnh phần góc nhọn bị bẻ gập xuống (hình 2.2B). Sử dụng panh nhọn mềm kẹp vào cánh ong rồi gắn sườn ngực giữa của ong vào chỗ lớp nhựa dán ở đỉnh của miếng giấy hình tam giác. Như vậy, quá trình gắn tiêu bản đã hoàn tất.
Hình 2.2. Phương pháp làm tiêu bản mẫu ong ký sinh (A): Cắm ghim trực tiếp, (B): Gắn mẫu trên miếng bìa cứng +) Ghi nhãn cho tiêu bản cắm ghim
Sau ghi hoàn thành việc làm mẫu tiêu bản cắm ghim, tất cả mẫu tiêu bản cần được ghi nhãn theo các dữ liệu khi thu thập. Theo chuẩn của các bảo tàng trên thế giới, nhãn mẫu tiêu bản được ghi theo thứ tự sau:
Vùng, tên Nước: Tên Tỉnh
Tên huyện/vườn QG/khu bảo tồn
Độ cao/tọa độ (nếu có) và cách thu mẫu Cây trồng/vật chủ
Thí dụ để tham khảo cách ghi nhãn trên tiêu bản ong ký sinh theo như dưới đây: N.E. VN: Vĩnh Phúc, Tam Đảo, 900m, rừng TS, vợt 30.IX.1990. N. V. A N.W.VN: Lào Cai, Sa Pa, Rau, từ sâu tơ,
30.VII.2001 N. V. B
S. VN: Kiên Giang, Phú Quốc, vườn quả, MT, 30.VII.2002 K. Đ. LONG
N.E. VN: Hà Nội, Gia Lâm, Đậu
tương, từ Omiodes
indicata
30.IV.1986 K.Đ.LONG
Thông thường, nhãn có kích thước nhỏ, những thông tin được ghi trong nhãn không chiếm quá 4 dòng, vì vậy, sử dụng font và cỡ chữ nhỏ để in nhãn. Sử dụng loại giấy có độ dày hơn 2 lần loại giấy in bình thường để làm nhãn.
b) Phương pháp đi ̣nh loa ̣i ong ký sinh
Phương pháp định loại côn trùng ký sinh dựa theo E. Mayer (1969) [21]. Bảng 2.1. Các bước định loại côn trùng ký sinh
Bước Nội dung
Chuẩn bị Phân chia các mẫu ong ký sinh thành các dạng hình thái giống nhau (phenon), lưu ý các mẫu vật ong ký sinh được vũ hoá từ một vật chủ được để riêng (bao gồm phenon con cái, phenon con đực).
Bước 1. Xác định họ ong ký sinh (ví dụ họ Eulophidae)
Tra khoá định loại để xác định họ ong ký sinh (dựa theo tài liệu chuyên khảo về ong ký sinh bộ Hymenoptera, phân bộ Chalcidoidea).
Bộ Hymenoptera -> phân bộ Chalcidoidea -> họ Eulophidae (Goulet H., Huber J. T., 1993)[44].
Bước 2. Xác định giống ong ký sinh (ví dụ giống Euplectrus)
Tra khóa định loại để xác định giống ong ký sinh (dựa theo tài liệu chuyên khảo về ong ký sinh họ Eulophidae).
Họ Eulophidae -> Giống (Burks R. A., 2003) [37].
Bước 3. Xác định loài ong ký sinh (ví dụ Euplectrus xanthocephalus Girault)
Tra khoá định loại để xác định loài ong ký sinh (dựa theo tài liệu chuyên khảo về ong ký sinh các giống thuộc họ Eulophidae)
Giống Euplectrus -> Loài Euplectrus xanthocephalus Girault
(Chao-Dong Zhu and Da-Wei Huang, 2002) [41].
Bước 4. Đối chiếu các đặc điểm của mẫu vật với đặc điểm chuẩn loại của loài
(Diagnosis)
Bước 5. Đối chiếu các đặc điểm của mẫu vật với các đặc điểm mô tả của loài
ở cả con cái và con đực.
Bước 6. Đối chiếu đặc điểm của mẫu vật với các hình vẽ định loại.
Bước 7. Đối chiếu kích thước đo đếm của mẫu vật với kích thước của loài.
Bước 8. Kiểm tra vùng phân bố địa lý của loài và kiểm tra vật chủ ký sinh của loài.
Kiểm tra sự phân bố địa lý của loài trong các tài liệu định loại: Nếu loài đã xác định có phân bố ở Việt Nam hay ở các nước lân cận như Thái Lan, Trung Quốc,… hoặc vùng Đông Phương (Orient), thì bước định loại sơ bộ xem như đã hoàn thành. Khi loài đã xác định chỉ phân bố ở vùng địa lý động vật khác với vùng Đông Phương thì có khả năng nghi ngờ, bởi vậy phải quay lại xác định từ đầu.
Bước 9. Đối chiếu mẫu vật với loài đã xác định của Viện Sinh thái và Tài
nguyên Sinh vật (PGS TS. Khuất Đăng Long thẩm định) và Viện Bảo vệ Thực vật (PGS TS. Phạm Văn Lầm thẩm định).
(Bộ mẫu côn trùng ký sinh ở Phòng BVTV, Khoa Nông Lâm Ngư) Bước 10. Mô tả loài và chụp ảnh, vẽ các đặc điểm theo vật mẫu.
Tài liệu định loại
Định loại ong, ruồi ký sinh chủ yếu dựa vào các tài liệu chuyên khảo của Ashmead W.H. (1904), Burks R.A. (2003), Chao-Dong Zhu, Da-Wei Huang (2001, 2002), Mani M.S., Saraswat G.G. (1972), Mohammad H., Mehdi H.S. (2004), Ubaidillah R. (2003), Khuất Đăng Long (2007) [37, 38, 41, 41, 45, 47, 53].