2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phương pháp lấy mẫu
Rễ cây sắn thuyền được lấy tại Trung tâm lưu trữ mẫu – Bệnh viện Đông y tỉnh Thanh Hóa.
Mẫu khô được ngâm trong metanol thời gian 45 ngày. Đun nóng nhẹ dung môi (40 oC) chiết 3 lần, gộp tất cả dung môi lại chưng cất loại dung môi ở áp suất thấp thu được cao metanol dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Phương pháp tách và phân lập các hợp chất
Để phân lập các hợp chất, chúng tôi tiến hành lần lượt các phương pháp: - Sắc ký cột thường sử dụng silicagen cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (240 – 430 mesh).
- Sắc ký cột pha đảo silicagel; Sắc ký cột YMC. - Sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phương pháp phổ:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR được đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi DMSO, MeOD.
- Phổ 13C - NMR, DEPT được đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi MeOD.
- Phổ 2 chiều HSQC, HMBC.
(Các phổ được đo tại Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
2. 2. Thực nghiệm
2.2.1. Thiết bị và hóa chất2.2.1.1. Thiết bị 2.2.1.1. Thiết bị
- Cột sắc ký thường (chiều dài 1,4 m; đường kính 4,5 cm), (0,5 m; 2 cm). - Cột sắc ký pha đảo silicagel; Cột sắc ký YMC.
- Bộ chưng cất thường, Bộ chưng cất chân không. - Các thiết bị đo phổ.
- Máy quay cất chân không. - Các vật dụng cần thiết khác. 2.2.1.2. Hoá chất - Axit sunfuric. - Axeton. - Butanol. - Clorofom.
- Các dung môi đo phổ: DMSO, MeOD. - Etylaxetat. - Metanol. - Hexan. - Nước cất. - Iốt. - Silicagel.
Các hóa chất đều tinh khiết phân tích.
2.2.2. Tách và xác định cấu trúc các hợp chất
2.2.2.1. Chiết và tách các hợp chất từ rễ cây sắn thuyền.
Mẫu khô cân được 4,0 kg, sau đó được ngâm trong metanol trong thời gian 45 ngày. Lọc dịch chiết và chưng cất áp suất thấp thu hồi dung môi thu
được cao metanol (0,5 kg). Phần bả còn lại tiếp tục ngâm với metanol trong thời gian 7 ngày rồi chiết nóng 3 lần thu thêm được 0,1 kg cao.
Cao metanol phân tán vào nước cất rồi lần lượt chiết với các dung môi hexan, clorofrom, etylaxetat, chưng cất loại bỏ các dung môi thu được cao tương ứng.
Phần nước còn lại quay cất chân không được cặn nước. Cặn nước tiến hành sắc ký cột pha đảo silicagel dung môi CHCl3:MeOH: H2O thu dược 5 phân đoạn,
Phân đoạn 4 sắc ký lại cột YMC dung môi MeOH: H2O (1:1) thu được hợp chất TRD 114,
Phân đoạn 5 sắc ký lại bằng cột silicagel dung môi CHCl3:MeOH: H2O (4:1:0,1) thu được hợp chất TRD 122.
Hợp chất TDR 114 có dạng tinh thể, màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 291 - 292 oC,
Hợp chất TDR 122 có dạng tinh thể, màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 234 - 235 oC.
2.2.2.2. Xác định cấu trúc hợp chất
Để xác định cấu trúc các hợp chất, chúng tôi sử dụng kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR được đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi DMSO, MeOD.
- Phổ 13C - NMR, DEPT được đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi MeOD.
Ngâm trong metanol 45 ngày
Lọc dịch chiết và chưng cất loại dung môi
Phân tán vào nước Chiết với các dung môi
sau đó chưng cất loại dm n-hexan clorofom etylaxetat
Cao n-hexan Cao etylaxetat
quay cất chân không
CC, Silicagel CHCl3:MeOH: H2O (5:1:0,1) CC, YMC CC, Silicagel MeOH:H2O CHCl3:MeOH:H2O (1:1) (4:1:0,1)
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tách các hợp chất từ rễ cây sắn thuyền CAO METANOL Bã mẫu Dịch nước Cao clorofom Cặn H2O Phân đoạn 5 Phân đoạn 4 Hợp chất TDR 122 Hợp chất TDR 114
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Xác định cấu trúc của hợp chất A (TDR 114)